La pérdida de actividad de Mst1/2 promueve la no

Jul 07, 2023

npj Regenerative Medicine volumen 7, Número de artículo: 64 (2022) Citar este artículo

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Las células ciliadas sensoriales (HC) de mamíferos tienen una capacidad limitada de regeneración, lo que conduce a una pérdida auditiva permanente después de la muerte de HC. Aquí, utilizamos la secuenciación de ARN in vitro para mostrar que la vía de señalización de Hippo está involucrada en el daño de HC y los procesos de autorreparación. La desactivación de la señalización de Hippo a través de la inhibición de Mst1/2 o la sobreexpresión de Yap induce la acumulación nuclear de YAP, especialmente en las células de apoyo, lo que induce la producción de HC supernumerarios y la regeneración de HC después de la lesión. Mecánicamente, estos efectos de la señalización Hippo funcionan de forma sinérgica con la vía Notch. Es importante destacar que los HC supernumerarios no solo expresan marcadores de HC, sino que también tienen estructuras de cilios que pueden formar conexiones neuronales con regiones auditivas in vivo. En conjunto, la regulación de Hippo sugiere nuevas estrategias para promover la proliferación de células de apoyo coclear, la regeneración de HC y la reconexión con neuronas en mamíferos.

El daño de las células ciliadas (HC) provoca una pérdida auditiva neurosensorial permanente y afecta a millones de personas en todo el mundo1,2. Los HC de mamíferos adultos dañados carecen de capacidad regenerativa3,4, aunque las células de soporte (SC) son un recurso potencial para regenerar HC5,6. Cuando las HC se dañan en la cóclea de mamíferos neonatales, las SC pueden regenerar HC ya sea a través de la regeneración mitótica o mediante la transdiferenciación directa después de activar las células madre o las células progenitoras, pero esta capacidad regenerativa es bastante limitada7,8,9,10,11. Es importante destacar que la regeneración de HC no ocurre cuando se induce la ablación de HC después de una semana de edad in vivo12,13. Las interacciones y los mecanismos subyacentes a la regeneración requieren más investigación, particularmente en el contexto de los paradigmas de daño celular.

La señalización de hipopótamo es una vía de señalización altamente conservada que desempeña funciones pleiotrópicas en la modulación de la proliferación, diferenciación, supervivencia y muerte celular14. En los mamíferos, la vía del hipopótamo consiste en las serina/treonina cinasas 1/2 (MST1/2) y el supresor de tumores grandes 1/2 (LATS1/2) de mamífero estéril tipo 20, mientras que la proteína asociada a Sí (YAP) es la principal mediador aguas abajo de la vía Hippo15,16,17. Tras la estimulación, MST1/2-SAV1 fosforilado activa el complejo LATS1/2-MOB1a/b, que a su vez fosforila el efector transcripcional aguas abajo YAP para promover su localización citoplasmática, que se denomina Hippo-on18. En ausencia de fosforilación, YAP se desvía hacia el núcleo (Hippo-off), donde coopera con el cofactor transcripcional Tead para regular sus genes diana que están implicados en la proliferación y diferenciación celular19,20.

Estudios anteriores se centraron en el importante papel de la señalización de Hippo en la tumorigénesis porque la regulación positiva de la señalización de Hippo promueve el crecimiento celular e inhibe la apoptosis celular en casi todos los tejidos tumorales21, especialmente su interacción con otras vías de señalización22,23. El análisis comparativo de micromatrices demostró que la expresión génica inducida por la deficiencia de Yap cambia en la vía de señalización de Wnt, y esto puede estar asociado con la regeneración de HC (neuromast) en el pez cebra24. En el sistema auditivo, Gnedeva et al. informaron que la pérdida condicional de Yap se asoció con la salida del ciclo celular durante la etapa embrionaria en el órgano de Corti y condujo a órganos sensoriales significativamente más pequeños25. Los hallazgos de Rudolf et al. sugirió que el daño celular supera la señalización inhibidora de hipopótamos y facilita la proliferación regenerativa en utrículos de no mamíferos, mientras que la supresión de la señalización de YAP-TEAD en utrículos de mamíferos contribuye a mantener la quiescencia proliferativa26. Las diferentes localizaciones celulares de YAP pueden explicar parcialmente las capacidades regenerativas de los utrículos en pollitos27. Sin embargo, la mayoría de los estudios sobre la vía de señalización Hippo se han centrado en su función de inhibir la proliferación celular y promover la retirada del ciclo celular en el oído interno, y no en su aplicación para promover la regeneración de HC.

En este estudio, nos enfocamos en la señalización de Hippo en la cóclea del ratón y descubrimos que está involucrada en los procesos de regeneración de HC. Además, encontramos que la acumulación nuclear de YAP aumenta después del insulto de neomicina, y la promoción de YAP para ingresar al núcleo da como resultado una mayor generación de HC supernumerarios en ratones recién nacidos. Más importante aún, nuestros resultados demostraron que los HC recién generados inducidos después de la eliminación de Mst1/2 en células de soporte (SC) positivas para Sox9 eran funcionales in vivo, lo cual es particularmente notable en los mamíferos.

Los antibióticos aminoglucósidos (como la neomicina) son toxinas conocidas para los HC cocleares, y se encontró una pérdida progresiva de HC en la cóclea desde los giros apicales hasta los basales después del tratamiento con neomicina (Fig. 1a-c, Fig. S1). Mientras tanto, se observaron muy pocas SC proliferativas en tales situaciones, y estas se distribuyeron principalmente en los giros apicales (Fig. 1d). Con el fin de explorar el mecanismo molecular basado en la proliferación de SC, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) de datos de RNA-seq normalizados para investigar las variaciones generales entre y dentro de los dos grupos. Las células tratadas con neomicina y las células de control formaron distintos grupos a lo largo de PC1, lo que explicó el 86 % de la varianza. La varianza dentro del grupo fue revelada por PC2, que representó solo el 7% de la varianza. A partir del gráfico del volcán y el análisis de ontología genética, encontramos que el complejo de ribonucleoproteínas y la biogénesis de los ribosomas estaban significativamente regulados al alza, lo que estaba estrechamente relacionado con la proliferación o regeneración celular (Fig. S2). El análisis de la vía de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto mostró que un gran número de vías de señalización, incluidas Hippo y Notch, estaban involucradas en el proceso de muerte de HC o proliferación de SC (Fig. 1e). Nos enfocamos en los cambios en la señalización de Hippo después del daño de HC y encontramos que 56 genes en la vía de señalización de Hippo y entre sus genes posteriores estaban asociados con procesos de reparación y daño de HC, incluidos Mst1, Lats1 / 2, Mob1b y Amotl2 (Fig. 1f) .

Se aisló una cóclea de ratones neonatales P2 y se cultivó durante 12 h, luego se dañó con neomicina 1 mM durante 6 h y se cultivó durante otros 5 días con EdU 10 μM. b, c Después del daño por neomicina, la muerte de HC aumentó desde el ápice hasta la base de la cóclea (Myosin7a+ HCs, ápice: 109,0 ± 6,4; medio: 76,7 ± 6,7; base: 43,0 ± 4,6), y ANOVA de dos vías seguido de Sidak La prueba de comparación múltiple mostró que hubo una diferencia significativa en los giros medio y basal. d Se observaron muy pocas SC proliferativas después del daño de HC (SC Sox2/EdU doblemente positivo, vértice: 2,4 ± 0,6; centro: 1,4 ± 0,5; base: 0,6 ± 0,4), aunque el ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak mostró la diferencia significativa en los giros apical y medio. e Análisis de ruta de la Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) de los datos del transcriptoma. f Mapa de calor que muestra los niveles de expresión relativos de los genes expresados ​​​​diferencialmente asociados con la vía de señalización de Hippo después del daño de HC. (FDR < 0,01; n = 3 para cada condición). Los genes expresados ​​más altos se muestran en rojo, mientras que los genes con niveles relativamente más bajos se muestran en azul. Las cócleas g-i de ratones P2 se diseccionaron y cultivaron durante 12 h y luego se trataron con neomicina 1 mM durante 6 h. La tinción inmunohistoquímica se realizó después de otro cultivo de 24 h. En comparación con los grupos de control, la tinción inmunohistoquímica y los resultados del análisis cuantitativo de fluorescencia relativa analizados con pruebas t de Student no pareadas de dos colas mostraron que la acumulación nuclear de YAP (rojo) en Sox2+ SC (blanco) aumentó después de la lesión con neomicina. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos se muestran como la media ± SEM. Barras de escala = 20 μm.

Además, observamos que la acumulación nuclear de YAP en SC podría desencadenarse por insulto de neomicina (Fig. 1g-i). Se ha informado que la acumulación nuclear de YAP disminuye rápidamente en el órgano de Corti desde los embriones hasta los recién nacidos25, como lo confirman nuestros resultados (Fig. S3), lo que sugiere que la translocación de YAP del citoplasma al núcleo está asociada con la capacidad regenerativa de la cóclea. células.

XMU-MP-1, un inhibidor28 selectivo de MST1/2, se utilizó para desactivar farmacológicamente la señalización de hipopótamo en la cóclea del ratón (Fig. 2a). YAP aumentó en el núcleo SC (Fig. 2b-h), y la expresión de genes aguas abajo relacionados con Hippo aumentó de manera dependiente de la dosis (Fig. 2i). La proporción de YAP nuclear aumentó y el nivel de YAP fosforilado disminuyó en el órgano de Corti después de la incubación con XMU-MP-1, mientras que el nivel de LATS-1 fosforilado disminuyó (Figs. 2j, k, S4).

Se aislaron y cultivaron cócleas de ratones neonatales P2. Después de 12 h, se añadió XMU-MP-1 1 μM o 5 μM durante 24 h. b–g La distribución de YAP (rojo) en Sox2+ SC (blanco) del control neonatal P2 y cócleas de ratón tratadas con XMU-MP-1 1 µM o 5 µM, respectivamente. Las flechas amarillas indican que la acumulación nuclear de YAP fue muy baja en el grupo de control, mientras que las flechas blancas indican que la acumulación nuclear de YAP aumentó en los grupos XMU-MP-1. h La fluorescencia relativa de YAP en los núcleos y el citoplasma de las SC en los grupos de control y tratados con XMU-MP-1 se analizó con ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett, lo que indica que XMU-MP-1 promovió significativamente la translocación de YAP en el núcleo. i Los niveles relativos de expresión de ARNm de los genes relacionados con la ruta Hippo y los genes aguas abajo después del tratamiento exógeno con XMU-MP-1 analizados con ANOVA unidireccional seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Tukey. j, k Los western blots y la cuantificación de fluorescencia relativa de p-YAP, p-LATS, YAP y LATS en el grupo de control y los grupos XMU-MP-1 analizados con ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos se muestran como la media ± SEM. Barras de escala = 20 μm.

Luego generamos Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+ ratones transgénicos para apagar Hippo específicamente en SC in vivo (Fig. 3a), lo que confirmó que la desactivación condicional de Mst1/2 en SC impulsa la translocación de YAP en los núcleos de SC (Fig. 3b, c). El diagrama esquemático de la Fig. 3d muestra las estructuras y los subtipos de células de la cóclea. Confirmamos que no hubo una diferencia significativa entre los ratones transgénicos Mst1fl/fl/Mst2fl/fl y los ratones de tipo salvaje (WT) sin activación de Cre (Fig. S5). Con la inyección de tamoxifeno en los grupos de control WT, no se observaron células EdU+/Sox2+ en el día postnatal (P)7, lo que indica que las SC postnatales estaban mitóticamente inactivas después del nacimiento (Fig. 3e). Sin embargo, la inyección de tamoxifeno resultó en una cantidad significativa de células Sox2+/EdU+ en los ratones knockout para Mst1/2 tanto en la región sensorial (SR) como en la cresta epitelial mayor (GER) (Fig. 3e-h). Específicamente, varios genes relacionados con la señalización de Hippo cambiaron tanto en los niveles de transcripción como de traducción (Figs. S6, S7).

un Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Se usaron ratones Sox9-CreERT2/+ para eliminar Mst1/2 en SC Sox9+ y, por lo tanto, apagar la señalización Hippo para promover la translocación nuclear YAP. Se inyectó tamoxifeno en P1-2, y EdU se inyectó en P2-7 y las cócleas se recolectaron en P7. b En comparación con los grupos de control, hubo mucha más translocación nuclear YAP en Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Ratones Sox9-CreERT2/+. Los núcleos están rodeados de blanco. En comparación con los controles, se transfirió más YAP al núcleo celular en el grupo de eliminación de Mst1/2. c La fluorescencia relativa de YAP en los núcleos y el citoplasma de SC en control y ratones knockout para Mst1/2 se analizó con pruebas t de Student no apareadas de dos colas, lo que indica que la knockout de Mst1/2 promovió la translocación de YAP en el núcleo. d El diagrama esquemático de las vistas en sección del órgano de Corti. DC, celda de Deiters; PC, celda pilar; IPhC, celda de la falange interna; IBC, celda del borde interior; RGE, cresta epitelial mayor. e–h Se detectaron muy pocas SC EdU+ en los ratones de control, y el ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak mostró que había un número significativamente mayor de SC Sox2+/EdU+ en el SR y el GER con la cantidad total de SC Sox2+ disminuyendo en Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Ratones Sox9-CreERT2/+. i–m Hubo un gran número de HC recién generados entre los IHC y los OHC, y se detectaron muchos HC Sox2+/Myosin7a+ tanto en los IHC como en los OHC de Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Se realizaron ratones Sox9-CreERT2/+ (i), y ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak para mostrar las diferencias significativas. n Se observaron muy pocos HC Myosin7a+/EdU+, alrededor de 0–2 por cóclea, en Mst1f1/f1/Mst2fl/fl; Ratones Sox9-CreERT2/+. o El diagrama esquemático de la proliferación SC en ratones knockout para Mst1/2 in vivo. p El diagrama esquemático de HC supernumerarios en ratones knockout para Mst1/2 in vivo. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos se muestran como la media ± SEM. Barras de escala = 20 μm.

Myosin7a se usó como marcador para HC, mientras que Sox2 se usó como marcador SC29,30. En la capa HC de los ratones P7, había un gran número de células Myosin7a+/Sox2+ en los ratones transgénicos, pero no se observó ninguna en los compañeros de camada de control. El número total de HC internos (IHC) y HC externos (OHC) fue significativamente mayor, mientras que el número total de células Sox2 + en la capa SC fue menor en los ratones transgénicos que en los controles (Fig. 3i, j, k). Más interesante aún, hubo un número significativamente mayor de células Myosin7a+/Sox2+ en los ratones transgénicos, con una tendencia decreciente desde el ápice hasta la base en la cóclea (Fig. 3l, m). Se ha informado que algunas células que son Myosin7a+ también tienen núcleos Sox2+, lo que sugiere que son HC recién generados a partir de células Sox2+ pero aún en una etapa inmadura30,31. Por lo tanto, la diferenciación directa de SC en HC a través de la translocación nuclear YAP resultó en un mayor número de HC y una disminución en el número de SC (Fig. 3f, j, k). Además, se encontraron células raras Myosin7a+/EdU+ en los ratones transgénicos, lo que indicaba la existencia de alguna generación mitótica de HC (Fig. 3n). En conclusión, tanto la diferenciación directa como la generación mitótica de HC a partir de SC a través de la translocación nuclear YAP ocurrieron simultáneamente en ratones knockout condicionales Mst1/2, pero la diferenciación directa fue el mecanismo dominante (Fig. 3o, p).

Sox9 es miembro de la familia Sox de reguladores transcripcionales. Se expresa principalmente en SC en la etapa de desarrollo del oído interno32. Para identificar el origen de los SC proliferantes y los HC supernumerarios inducidos por la translocación nuclear YAP, el Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+; Se crearon líneas de ratón Rosa26-tdTomato/+ para eliminar condicionalmente Mst1 y Mst2 en los SC Sox9-tdTomato+. Los resultados sugirieron que tanto las SC proliferativas como las HC diferenciadas se originaron a partir de las SC Sox9+. Además, las células Myosin7a+/EdU+ poco frecuentes también se derivaron de células Sox9-tdTomato+ y correspondieron a HC generadas mitóticamente en las SC Sox9+ rastreadas por linaje (Fig. S8). En resumen, la mayoría de los HC supernumerarios eran Sox9-tdTomato+/EdU–, lo que nuevamente ilustra que la diferenciación directa dominó la generación de HC al inhibir la señalización de Hippo y que estos nuevos HC derivaron de Sox9-tdTomato+ SC.

Para identificar los subtipos de los HC recién generados en Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Se utilizaron ratones Sox9-CreERT2/+, vGlut3, Prestin y Oncomodulin (OCM) para etiquetar los nuevos HC supernumerarios. Las células Myosin7a+ en la región OHC expresaron Prestin, mientras que las de la región IHC expresaron vGlut3 (Fig. 4a-f). Un estudio anterior mostró que el marcaje de OCM se limitaba principalmente a los OHC, con algo de marcaje de inmunorreactividad en los IHC en las primeras etapas de desarrollo33. Sorprendentemente, nuestros resultados indicaron que casi todos los HC nuevos eran OCM+ en los ratones transgénicos, mientras que la inmunorreactividad de OCM se observó casi exclusivamente en los OHC en el grupo de control con una expresión muy baja entre las filas de IHC en P7. Este resultado indicó que los HC recién generados eran diferentes de los HC originales hasta cierto punto, y tal vez eran más inmaduros.

a–f Los HC ectópicos supernumerarios en Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Los ratones Sox9-CreERT2/+ se tiñeron con el marcador IHC vGlut3 y el marcador OHC Prestin. En comparación con los ratones WT, los HC recién generados se etiquetaron con OCM a pesar de estar ubicados en la región IHC y OHC. g Se usó faloidina para etiquetar la estructura de los estereocilios, y se usó Tuj1 para etiquetar la fibra nerviosa. Se observó una estructura en forma de "V" en los OHC y una estructura en forma de "-" en los IHC marcadas con faloidina y rodeadas por conexiones ordenadas de fibras nerviosas que fueron marcadas por Tuj1 en ratones de control P7. h En P7 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; En ratones Sox9-CreERT2/+, casi todos los HC, incluidos los HC regenerados, tenían estructuras en "V" y "-" de forma similar marcadas por faloidina en los OHC y los IHC, respectivamente. El etiquetado de Tuj1 mostró 1 a 2 filas de HC internos y 3 a 5 filas de HC externos rodeados de fibras nerviosas irregulares. i, j Las vistas en sección de la tinción con faloidina y Tuj1 en ratones de control y transgénicos en P7. k–m La vista representativa de las estructuras ciliares desde el giro apical hasta el basal del órgano de Corti en ratones WT bajo un microscopio electrónico. n–p En compañero de camada P7 Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; En ratones Sox9-CreERT2/+, se detectaron mechones de pelo inmaduro con una disminución del giro apical al basal. A la derecha se muestran las vistas ampliadas de los paquetes IHC y OHC in situ en ratones control y Mst1/2 knockout y los paquetes de cabello ectópico inmaduro con microvellosidades ligeramente más largas y un kinocilio desde el giro apical hasta el basal. Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+; Se usaron ratones Rosa26-tdTomato/+ para realizar el experimento de pinzamiento de parche. Después de la inyección de tamoxifeno en P1-2, se recolectaron las cócleas en P7, por lo que los HC Sox9-tdTomato+ se pudieron observar bajo un microscopio. r Corrientes de K+ salientes representativas de WT P7 OHC provocadas por los pasos de voltaje que se muestran arriba. s Corrientes salientes de K+ representativas de HC regenerados en ratones transgénicos provocados por los mismos pasos de voltaje que se muestran arriba. t Media ± SEM IK (corriente de potasio del rectificador retardado) en respuesta a la despolarización de 0 mV de WT P7 OHC (n = 10) y HC regenerados (n = 19). u Promedio ± SEM de las relaciones pico de corriente-voltaje de los OHC WT P7 y los HC regenerados. Los datos se muestran como la media ± SEM. Barras de escala = 20 μm en (a–f, g, h). Barras de escala = 5 μm en el aumento bajo y 2 μm en el aumento alto, respectivamente en (k–p).

Tuj1 se usó para etiquetar las proyecciones neuronales auditivas rodeadas de células similares a HC regeneradas in vivo. Una fila de IHC y tres filas de OHC estaban rodeadas por conexiones de fibras nerviosas en los ratones de control. Por el contrario, había 1 o 2 filas de IHC y de 3 a 5 filas de OHC en los ratones transgénicos, y las neuritas alrededor de cada HC crecieron hasta el SR como se ve en las secciones coronal y axial (Fig. 4g-j). Los estereocilios de los HC cocleares se organizaron como una estructura en forma de "V" reconocible en los OHC y una estructura en forma de "-" en los IHC en ambos grupos, mientras que los cilios de los HC regenerados estaban ligeramente desorganizados y desalineados en el transgénico. ratones. Se utilizó microscopía electrónica de barrido para visualizar mejor los cilios de los HC recién regenerados, y encontramos mechones de cabello inmaduros en los nuevos HC en P7 (Fig. 4k-p). Estos resultados proporcionan evidencia del estado de los HC recién generados in vivo, que tienen estructuras ciliares similares pero inmaduras en comparación con los ratones WT. Además, la fluorescencia verde del colorante FM1-43FX se marcó conjuntamente con tdTomato después de la eliminación de MST1/2 en Sox9+ SC, lo que indicó que los nuevos HC tenían canales de transducción funcionales (Fig. S8i).

Se realizó un experimento de pinzamiento de parche de células completas en estos HC supernumerarios. Se registraron corrientes de K+ salientes sostenidas en los HC recién generados, similares a los HC en el transcurso del desarrollo en el órgano de Corti. Estos resultados indicaron que los HC regenerados in vivo tienen algunos canales de transducción y funcionalidad electrofisiológica (Fig. 4q-u).

El efecto de XMU-MP-1 en cócleas dañadas por neomicina in vitro se ilustra en la Fig. 5a. Descubrimos que se generaron muchas más células Myosin7a+/Sox9-tdTomato+ con el tratamiento con XMU-MP-1 en comparación con las cócleas de control (Fig. 5b, c). Numéricamente, se encontraron más células Sox9-tdTomato+/Myosin7a+ en el grupo tratado con XMU-MP-1, con un patrón decreciente desde el ápice hasta la base (Fig. 5d), lo que indica que un gran número de Sox9+ SC se había diferenciado directamente en HC en respuesta a XMU-MP-1.

un Sox9-CreERT2/+; Rosa26R-tdTomato/+ y Atoh1-CreEsr1/+; Se usaron modelos de ratón Rosa26R-tdTomato/+ para rastrear los linajes SC y HC. Se inyectó tamoxifeno en P1 para activar la expresión de tdTomato durante la noche, y las cócleas se recolectaron en P2 y luego se cultivaron in vitro. Después de la exposición a neomicina durante 6 h, los explantes cocleares se cultivaron con XMU-MP-1 exógeno o DMSO al 0,5 % durante 5 días. b–d En comparación con los controles, los números de Myosin7a+/Sox9-tdTomato+ HC aumentaron en gran medida del giro apical al basal en el grupo tratado con XMU-MP-1 analizado con ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. p.ej. Hubo un gran número de Myosin7a+/Atoh1-tdTomato– HC en los grupos tratados con XMU-MP-1 en comparación con los controles analizados con ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. h El diagrama esquemático de Myosin7a+/Sox9-tdTomato+ HC después del tratamiento con XMU-MP-1. i El diagrama esquemático de Myosin7a+/Atoh1-tdTomato– HC después del tratamiento con XMU-MP-1. j, k Los explantes cocleares de ratones P2 WT se recolectaron y luego se cultivaron. Después de la exposición a neomicina durante 6 h, los explantes se cultivaron con XMU-MP-1 exógeno o DMSO al 0,5 % durante 24 h. Los resultados de la tinción inmunohistoquímica mostraron que la adición de XMU-MP-1 aumentó significativamente la acumulación nuclear de YAP1 en las SC Sox2+ después de la lesión por neomicina. l, m Después de la lesión por neomicina, las cócleas se cultivaron con DMSO o XMU-MP-1 durante otros 5 días, y se añadió EdU 10 μM todo el tiempo para rastrear las células en proliferación. En el grupo de control con tratamiento con DMSO, no se detectaron HC en proliferación y muy pocas SC. En el grupo tratado con XMU-MP-1, hubo algunas EdU+ SC y HC desde el giro apical hasta el basal. n Los HC de EdU+ se distribuyeron principalmente en el túnel entre los HC internos y externos, y aparecieron principalmente en pares y teñidos con Sox2. o–q En comparación con los grupos de control, hubo un aumento significativo en el número de SC y HC en proliferación después de la adición de XMU-MP-1 in vitro analizada con ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. El número total de HC se incrementó significativamente. r–t Solo alrededor del 16% de los HC eran EdU+ en comparación con la mayor proporción de HC en el giro apical; sHC: HC supernumerario. u El diagrama esquemático de los HC regenerados mitóticamente y los SC proliferantes. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos se muestran como media ± SEM. Barras de escala = 20 μm.

Atoh1, que es un miembro de la familia de transcripción bHLH, es necesario y suficiente para el desarrollo temprano de HC del oído interno34. En Atoh1-CreEsr1/+; Rosa26R-tdTomato/+, encontramos que en el grupo de control la mayoría de los HC eran Atoh1-tdTomato+, mientras que en los ratones transgénicos las células Myosin7a+/Atoh1-tdTomato– estaban en el túnel entre los IHC y los OHC (Fig. 5e -gramo). Estos resultados indicaron que XMU-MP-1 aumentó significativamente la diferenciación de HC después del insulto con neomicina, y los HC regenerados se diferenciaron principalmente de los progenitores Sox9 + en lugar de los HC Atoh1-tdTomato + (Fig. 5h, i). La distribución de las células Sox9-tdTomato+ y las células Atoh1-tdTomato+ en la capa HC sin daño por neomicina se muestra en la Fig. S9a, b.

En ratones WT, la adición de XMU-MP-1 aumentó significativamente la acumulación nuclear de YAP1 en SC Sox2+ después de la lesión con neomicina (Fig. 5j, k) y no se encontraron células Myosin7a+/EdU+, pero se encontraron algunas células Sox2+/EdU+ en la neomicina grupo de control. Por el contrario, se encontraron cantidades significativamente mayores de células Sox2+/EdU+ y Myosin7a+/EdU+ en las cócleas tratadas con XMU-MP-1 (Fig. 5l-q). Curiosamente, casi todas las células Myosin7a+/Sox2+/EdU+ estaban presentes juntas en pares. Además, encontramos que la mayoría de los HC que proliferan mitóticamente se ubicaron entre los IHC y los OHC, que es la región donde se enriquecen las células precursoras7 (Fig. 5n). Estos resultados sugirieron que la regulación de la señalización de Hippo podría ser un regulador proliferativo SC dependiente del contexto que induce una proliferación significativamente mayor de SC en el caso de cócleas dañadas. Además, los HC generados mitóticamente (EdU+/Myosin7a+/Sox2+) aumentaron claramente en comparación con las cócleas intactas (Fig. S9c, d), pero aún no eran el tipo de célula principal resultante de la regeneración de HC inducida por translocación nuclear YAP in vitro (Fig. .5q–u).

Como indicaron los resultados anteriores, la proteína YAP aumentó en el núcleo SC después del daño con neomicina (Fig. 1g-i). Además, XMU-MP-1 promovió la translocación nuclear de YAP en SC de manera dependiente de la dosis, no solo en la condición intacta (Fig. 2b-g), sino también en la condición de daño de neomicina (Fig. 5j, k), que proporcionó más pruebas sólidas de que la translocación nuclear de YAP está asociada con la regeneración de HC.

A continuación, intentamos determinar si apagar Hippo inició la generación de HC supernumerarios a través de la estimulación de la translocación nuclear YAP. Se usó adenovirus como vector para la transfección eficaz de los explantes cocleares y se generaron adenovirus recombinantes (Ad-YAP y Ad-YAP-GFP) para sobreexpresar Yap1. Se seleccionó la concentración óptima de 3 × 109 PFU/ml de adenovirus para un análisis posterior (Fig. 6a-g). Se encontró un número significativamente mayor de células Myosin7a+ y Myosin7a+/EdU+ en las cócleas tratadas con Ad-YAP (Fig. 6h-k). Estos resultados sugirieron que la diferenciación directa dominó la regeneración de HC en comparación con los HC generados mitóticamente.

a Después de la exposición a neomicina durante 6 h, los explantes cocleares se cultivaron con Ad-GFP/Ad-Yap-GFP exógenos durante 48 h, y la eficiencia de transfección basada en la fluorescencia de GFP se analizó en SC Sox2+ en el SR. b, c Se contaron las células GFP+/Sox2+ y los resultados mostraron que la eficacia de la transfección aumentó con el aumento de las concentraciones de adenovirus (107, 108, 109, 3 × 109 y 1010 UFP/ml). d Se calculó el número de SC Sox2+ tratadas con diferentes concentraciones de adenovirus. Se encontró que el número de SC disminuyó ligeramente a alta concentración. e, f Para regular al alza la expresión de Yap, los explantes cocleares después de la agresión con neomicina durante 6 h se trataron con Ad-Yap-GFP durante 48 h. Se realizó la prueba t de una muestra y mostró que YAP aumentó significativamente con una concentración de 3 × 109 UFP/ml de adenovirus, y la distribución de YAP en el núcleo aumentó significativamente. g Se realizó el nivel relativo de expresión de ARNm de la señalización Hippo y los genes diana aguas abajo después del tratamiento con Ad-Yap-GFP, y ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak para mostrar las diferencias significativas. h–k Después de la exposición a neomicina durante 6 h, los explantes cocleares se cultivaron con Ad-mus-Yap1 o Ad-null durante 7 días, y se agregó EdU 10 μM todo el tiempo para rastrear las células en proliferación. En el grupo de control con tratamiento sin Ad, no se detectaron HC o SC en proliferación. En el grupo de tratamiento con Ad-mus-Yap1, hubo significativamente más EdU+ SC y HC desde el giro apical hasta el basal analizados con ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. En comparación con los controles, el número de HC aumentó significativamente desde el giro apical hasta el basal analizado con ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos se muestran como la media ± SEM. Barras de escala = 20 μm en (b) y (h), Barras de escala = 10 μm en (e).

En nuestro estudio anterior, encontramos que la regulación coordinada de la activación de Wnt y la inhibición de Notch podría promover la regeneración de HC en la cóclea de ratón posnatal7,35. Al analizar las transcripciones de las cócleas después de la lesión con neomicina, el análisis de la red de interacción de proteínas usando STRING indicó que la expresión de los genes relacionados con la vía de señalización Hippo, Notch y Wnt varió notablemente en el proceso de regeneración (Fig. 7a). Los resultados de RT-qPCR indicaron que la inhibición de Hippo estuvo acompañada por una regulación positiva de genes relacionados con la transformación de HC (Atoh1, Brn3.1), la vía de señalización de Notch (Jag1, Hes1 y Hes5) y Yap/Taz y sus genes efectores aguas abajo (ACTG y Amotl2) en las cócleas tratadas con XMU-MP-1 después del insulto con neomicina (Fig. 7b).

a Análisis de red de interacción proteína-proteína de genes expresados ​​​​diferencialmente de las vías de señalización Hippo, Notch y Wnt. Las líneas moradas indican interacciones entre los genes Hippo y Wnt, y las líneas naranjas indican interacciones entre los genes Hippo y Notch. El color de los nodos indica el cambio de pliegue de la expresión génica. b Los explantes cocleares de ratones P2 de tipo salvaje se recolectaron y luego se cultivaron. Después de la exposición a neomicina durante 6 h, los explantes se cultivaron con XMU-MP-1 o DMSO durante 24 h. Se muestran los niveles de expresión de ARNm relacionados entre los grupos tratados con XMU-MP-1 y los controles, y se realizó ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparación múltiple de Sidak para mostrar las diferencias significativas. c Los explantes cocleares de ratones P2 WT se recolectaron y luego se cultivaron. Después de la exposición a neomicina durante 6 h, los explantes se cultivaron con compuestos exógenos (incluidos XMU-MP-1, BIO o DAPT) o DMSO al 0,5 % durante 3 días, y se añadió EdU 10 μM todo el tiempo para rastrear las células en proliferación. d-g El número total de HC y EdU+ HC no fue significativamente diferente entre los grupos tratados con XMU-MP-1 y XMU-MP-1/BIO. e, h, i El número de HC regenerados aumentó significativamente en el grupo tratado con XMU-MP-1/DAPT en comparación con el grupo tratado con XMU-MP-1. j Se realizó ANOVA de dos vías seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett y mostró que la regulación positiva de la señalización de Wnt por BIO podría promover la proliferación de SC. Sin embargo, la corregulación XMU-MP-1/DAPT generó más HC, incluidos EdU+ HC, y se encontraron grandes cantidades de SC proliferantes en el GER. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Los datos se muestran como la media ± SEM. Barras de escala = 20 μm.

Además, investigamos los efectos sinérgicos/antagonistas de apagar Hippo con otras señales (Fig. 7c). Se observaron algunos SC en proliferación y HC regenerados en el SR cuando la señalización de Hippo se apagó sola (Fig. 7d, e, j), mientras que se observó una gran cantidad de SC en proliferación (en el SR y GER) y casi ningún HC diferenciado directo cuando la vía Wnt se activó sola (con BIO) (Fig. 7f, j). Observamos algunos SC en proliferación y HC regenerados en el SR cuando el apagado de Hippo se combinó con la activación de Wnt (Fig. 7g, j). La proliferación de SC en el grupo combinado de inactivación de Hippo/activación de Wnt se inhibió significativamente en comparación con la activación de la vía de Wnt sola, pero se parecía a la de la regulación de la vía de señalización de Hippo sola, especialmente en el SR. Mientras tanto, los HC directamente diferenciados no se vieron afectados por la activación de Wnt, y sus números fueron similares a los observados al apagar solo la señalización de Hippo. Estos resultados indican que no existe un efecto sinérgico evidente de la activación de Wnt y la inactivación de Hippo.

Finalmente, se observaron algunas SC en proliferación y una gran cantidad de HC directamente diferenciadas en el SR cuando se inhibía solo la vía de Notch (Fig. 7h, j), y se observaron muchas SC en proliferación y HC regeneradas cuando la regulación positiva de Hippo se combinó con la supresión de Notch. (con DAPT) (Fig. 7I, j). Específicamente, la proliferación de SC se redujo significativamente en el SR en comparación con lo observado con la inhibición de Notch sola, pero la proliferación de SC se encontró principalmente en el GER. Además, el número de HC directamente diferenciados aumentó significativamente en comparación con apagar Hippo solo. Estos resultados sugieren que hubo un efecto sinérgico significativo de la señalización de Notch en la vía Hippo, especialmente en la promoción de la diferenciación directa de SC en HC. En conclusión, la regulación Hippo/Wnt/Notch, especialmente la combinación de Hippo y Notch, parece desempeñar un papel importante en la regeneración de HC del oído interno.

La señalización Hippo-YAP es un importante regulador de la homeostasis de los tejidos, el tamaño de los órganos y las células madre36. Nuestro análisis previo de secuenciación de ARN entre progenitores Lgr5+ tratados con neomicina e intactos reveló que Bmpr2, Wnt7a y Fzd7 estaban regulados al alza, mientras que Id1, Id2 e Id3 estaban regulados a la baja entre los genes de la vía Hippo37. En el presente estudio, nos enfocamos en la señalización de Hippo, y se demostró que 56 genes relacionados con Hippo están asociados con el daño de HC y los procesos de autorreparación. Nuestros resultados indicaron que los procesos biológicos de daño y reparación existieron simultáneamente en las cócleas dañadas.

Como regulador dependiente del contexto, la señalización Hippo está involucrada en la proliferación, diferenciación y apoptosis celular en varios subtipos de células38. YAP, como molécula efectora de la vía Hippo, es necesaria para ciertas especificaciones celulares durante las primeras fases del desarrollo embrionario20,39. Gnedeva et al. caracterizó el papel de YAP en el mantenimiento del estado proliferativo de los progenitores de órganos de Corti antes del establecimiento del dominio prosensorial posmitótico25. En respuesta al daño, la señalización independiente del hipopótamo puede promover el efecto de YAP para prevenir la transformación maligna40. Aquí mostramos el patrón intracelular de YAP en ratones neonatales (P2), con YAP distribuido principalmente en el citoplasma y solo señales débiles en el núcleo celular. La translocación citoplásmico-nuclear de YAP se inició con neomicina. Estos resultados sugieren que la acumulación nuclear de YAP podría desempeñar un papel importante en el proceso de daño y autorreparación de HC y que la regulación de la acumulación nuclear de YAP podría ser crucial para la regeneración de HC después del daño.

La señalización del hipopótamo juega un papel importante en el mantenimiento de la homeostasis y del tamaño de los órganos a través de bucles de retroalimentación bioquímica19,41. Se ha informado ampliamente que la señalización del hipopótamo regula el tamaño de los órganos y alcanza niveles homeostáticos al modular la proliferación, la supervivencia y la diferenciación en el tejido hepático de los mamíferos42,43,44,45. Un estudio reciente destacó el papel del complejo del factor de transcripción Yap/Tead, que es la molécula efectora de la vía Hippo, en el mantenimiento de las células progenitoras del oído interno durante el desarrollo25,26. Otros estudios han indicado que la activación de YAP en los cardiomiocitos posnatales puede estimular la expansión de los cardiomiocitos en la regeneración miocárdica terapéutica46,47. Aquí informamos el papel de la expresión y localización de Yap después del daño de HC en células cocleares de mamíferos neonatales. Los genes aguas abajo de la vía Hippo fueron regulados positivamente por XMU-MP-1, y esto podría estar estrechamente relacionado con la reprogramación SC y el proceso de regeneración HC.

Se ha informado que la pérdida de quinasas aguas arriba o la activación de YAP pueden regular las decisiones de crecimiento y destino celular en las células progenitoras39,48. Para investigar el efecto de la vía de señalización del hipopótamo en el oído interno, inhibimos farmacológicamente la vía de señalización del hipopótamo induciendo así la translocación nuclear de YAP in vitro, y además empleamos ratones knockout condicionales Mst1/2 para verificar el papel de la inhibición del hipopótamo en el oído interno en vivo. Observamos una cantidad de SC proliferantes, lo cual era consistente con sus funciones conocidas en la regulación del crecimiento y desarrollo de otros órganos20. Más importante aún, la generación proliferativa y la diferenciación directa de HC de SC se observaron en ratones transgénicos in vivo, y la translocación nuclear YAP podría reponer las HC dañadas por neomicina in vitro. Específicamente, más del 80% de los HC aumentados no proliferaron, lo que ilustra que la diferenciación directa fue el proceso dominante de generación de HC en respuesta a la inhibición de Hippo y que esto podría estar estrechamente relacionado con la proliferación limitada de SC. Además, usamos Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+; Rose26-tdTomato/+ linaje de ratón para mostrar que casi todos los HC supernumerarios se originaron a partir de Sox9+ SC. Estos resultados mostraron que la inhibición de Hippo podría promover la proliferación de SC e inducir la generación de HC supernumerarios al mantener el equilibrio dinámico entre los diferentes subtipos de células en el oído interno. Además, nuestros resultados demostraron que la translocación nuclear de YAP podría iniciar más generación mitótica y diferenciación directa en HC para reponer los HC dañados por neomicina, lo que podría ser un mecanismo de retroalimentación regulado por la señalización de Hippo. La regeneración de HC resultó en un número reducido de SC y, por lo tanto, indujo la proliferación de SC, lo que a su vez condujo a una nueva generación de HC49. Es posible que estos procesos no existan de forma independiente, sino que pueden influirse entre sí a través de un equilibrio dinámico dentro de un circuito cerrado.

Es notable que el daño de la neomicina junto con la inactivación de las quinasas MST1/2 por XMU-MP-1 induce de forma dependiente de la dosis la adquisición del destino de las células sensoriales principalmente a través de la diferenciación directa de las SC, acompañadas de algunas EdU+ HC. Sin embargo, en las cócleas no dañadas, con la desactivación de MST1/2 mediante el método transgénico, no pudimos encontrar una proliferación celular extensa excepto por un pequeño número de SC proliferadas o HC supernumerarias inmaduras. Presumimos que esta contradicción podría deberse a la diferencia entre el microambiente intacto y dañado por neomicina. Como se informó anteriormente, el daño podría desencadenar algunos mecanismos de regeneración de HC, especialmente en especies no mamíferas como aves y peces50,51. Por el contrario, los HC de mamíferos no pueden regenerarse espontáneamente. En el presente estudio, concluimos que Hippo-off a través de la inhibición de MST1/2 o la sobreexpresión de Yap induce la acumulación nuclear de YAP, especialmente en SC, lo que induce una pequeña cantidad de HC supernumerarios sin neomicina, o el número de HC aumenta con lesión de neomicina en vitro. Nuestros resultados indican que en la condición dañada, la señalización de Hippo podría eliminar algunas barreras en las SC para impulsarlas a diferenciarse directamente en HC. Este mecanismo necesita ser investigado más a fondo en el futuro.

Estructuralmente, existen conexiones neuronales entre los HC y los centros auditivos del cerebro. En Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; En el modelo de ratón Sox9-CreERT2/+, encontramos que los HC recién generados podían promover el crecimiento de neuritas. Es importante destacar que la formación de fibras nerviosas se observó in vivo, lo que respalda la hipótesis de que la generación de HC supernumerarios in situ atrae conexiones entre HC y neuronas, y esto sugiere que las nuevas HC podrían reconstruir las conexiones neuronales y, por lo tanto, tener el potencial para restaurar la audición. pérdida. Sin embargo, la capacidad regenerativa de los HC disminuye rápidamente con la edad in vivo e in vitro12,13. Por lo tanto, el trabajo futuro debería centrarse en comprender los mecanismos subyacentes detrás de estos procesos para desarrollar nuevas estrategias para recuperar la audición en los mamíferos.

En un estudio anterior, se informó que la activación mecánica de YAP/TAZ promueve el tallo epidérmico a través de la inhibición de la señalización de Notch52, y una gran cantidad de trabajo ha demostrado que las vías de señalización de Hippo, Wnt y Notch no funcionan de forma independiente y pueden influir entre sí. otro47,53,54,55. También se informó que la activación de la señalización de Wnt promovió la proliferación de SC y que la inhibición de la señalización de Notch estimuló la regeneración de HC7,35. Aquí, investigamos la influencia de estas dos vías de señalización clásicas en las funciones de Hippo en la promoción de la regeneración. La interacción entre la señalización de YAP y Notch influye en el desarrollo celular, la diferenciación celular, las decisiones sobre el destino celular, la morfogénesis, la inflamación, las interacciones del estroma epitelial y las oscilaciones de genes a gran escala56. Se ha informado que YAP/TAZ activa la expresión de Jagged-1 y, por lo tanto, promueve la diferenciación del músculo liso dependiente de Notch en la cresta neural55. En nuestro estudio, obviamente no hubo una mayor proliferación de SC o regeneración de HC en el SR con la regulación combinada de las vías Wnt e Hippo en comparación con la regulación de Hippo solo. Sin embargo, hubo una mayor proliferación de SC y más regeneración de HC en el SR en respuesta a la regulación combinada de las vías Notch e Hippo en comparación con la regulación de una sola vía de señalización a la vez. Estos resultados sugieren que la inhibición de la vía Notch tiene un efecto regulador sinérgico y positivo en la señalización de Hippo, y seguiremos investigando sobre la regulación secuencial de estas vías para verificar directamente estas suposiciones.

En conclusión, la acumulación nuclear de YAP en respuesta a la inhibición de Hippo puede promover una proliferación leve de SC y puede inducir la generación de HC supernumerarios en ratones recién nacidos, y promueve especialmente la transdiferenciación directa de SC junto con daño de neomicina principalmente en las vueltas apical a media de la cóclea. Brindamos amplia evidencia del efecto positivo de la inhibición de Hippo en la regeneración de HC y mostramos el efecto sinérgico con las vías de señalización de Notch y Wnt, que con suerte conducirán a nuevas estrategias para promover la proliferación de SC, la regeneración de HC y la reconexión con neuronas en el interior de los mamíferos. oreja.

Todos los ratones transgénicos (Tabla 1 superior) se obtuvieron del Laboratorio Jackson. Para la activación de Cre, se inyectaron intraperitonealmente 15 µl de tamoxifeno (Sigma) disueltos en aceite de maíz en ratones P1–2 (40 mg/ml). Para detectar células en proliferación, se inyectaron intraperitonealmente 20 µl del análogo de timidina EdU (Click-iT EdU Imaging Kit; Invitrogen) en ratones neonatos P2–7 (5 mg/ml).

Cumplimos con todas las normas éticas pertinentes para la experimentación y la investigación con animales. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Fudan, y se hicieron todos los esfuerzos para minimizar la cantidad de animales utilizados y evitar su sufrimiento.

Los ratones transgénicos se genotiparon con ADN genómico extraído de las puntas de las colas utilizando el sistema de extracción de ADN Viagen DirectPCR (Viagen). Los cebadores de genotipado se proporcionan en la Tabla complementaria 2.

El ARN total se extrajo de la cóclea con el esbozo de la estría vascular, el modiolo y la membrana tectorial eliminada usando TRIzol (Ambion). La síntesis de cDNA y las qPCR se realizaron con el kit de síntesis de cDNA PrimeScriptTM II 1st Strand (Takara) y TB GreenTM Premix Ex TaqTM II (Takara). Cada PCR se realizó por triplicado y la cuantificación relativa de la expresión génica se realizó mediante el método ΔΔCT con Gapdh como referencia endógena. Los pares de cebadores se diseñaron utilizando el software en línea Primer3, y las secuencias se proporcionan en la Tabla complementaria 3.

Se aislaron las cócleas de ratones neonatos P2 en condiciones estériles y se extrajo el esbozo de la estría vascular, el modiolo y la membrana tectorial con unas pinzas finas y, a continuación, se colocaron en cubreobjetos de 10 cm recubiertos previamente con adhesivo para células y tejidos Corning® Cell-Tak™. Los órganos completos se cultivaron en medio DMEM/F12 suplementado con N2/B27 (Invitrogen) y solución de ampicilina sódica (Sangon Biotech) en placas de Petri de cuatro pocillos. Para la agresión con HC, se añadió neomicina (1 mM, Sigma) después de cultivar durante 12 hy se añadió EdU 10 µM para detectar células en proliferación. En el modelo de cultivo coclear in vitro, XMU-MP-1 1 mM y 5 mM (Selleck), DAPT 5 µM (N-[N-(3,5-difluorofenacetil)-L-alanil]-S-fenil glicina t- butiléster, un inhibidor de secretasa γ-secretasa) y BIO 5 µM (6-bromoindirrubina-3'-oxima) para regular la actividad biológica de las vías de señalización Wnt y Notch.

Para construir los vectores de adenovirus de sobreexpresión de Yap recombinante, se prepararon pAd/CMV/V5-DEST Gateway® Vector, pAd/PL-DEST Gateway® Vector y 293 líneas celulares (Invitrogen, Carlsbad, California, EE. UU.). Se insertó ADNc de ratón para Yap (NM_001171147CDS) en los vectores adenovirales. El vector digerido y los segmentos del inserto se ligaron con ADN ligasa de T4. Se realizó una extensa extracción y empaquetamiento de los plásmidos virales, seguida de recolección y amplificación. Finalmente se obtuvo adenovirus recombinante con un título de 1,2 × 1010 UFP/ml. Para la transfección de explantes cocleares, se añadió al medio adenovirus recombinante (Ad-null, Ad-GFP, Ad-YAP y Ad-YAP-GFP) y se dejó incubar durante 48 h. Las concentraciones de virus recombinante fueron 107, 108, 109, 3*109 y 1010 UFP/ml. Los tejidos se prepararon para marcaje inmunohistoquímico y se analizaron 7 días después de la incubación del adenovirus.

Los tejidos se fijaron con paraformaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,1 M durante 10 min. Después de lavar con PBS tres veces, los tejidos se sumergieron en una solución de bloqueo que constaba de suero de burro al 10 % y Triton-X100 al 1 % en PBS a pH 7,4 durante 1 hora a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios y secundarios se diluyeron en Triton-X100 al 1 % en PBS durante la noche a 4 °C en una cámara humidificada. Después de lavar con PBS, los tejidos se montaron en medio de montaje de fluorescencia antidecoloración y se cubrieron con cubreobjetos. Los anticuerpos primarios utilizados en nuestros experimentos fueron anti-Myosin7a de conejo (dilución 1:500) (Proteus Biosciences), anti-Sox2 de cabra (dilución 1:500) (Abcam) y anti-YAP de ratón (dilución 1:50) (Santa Cruz). Los haces de HC se marcaron con faloidina (dilución 1:500) (Life Technologies), las fibras nerviosas se marcaron con Tuj1 (dilución 1:500) (Abcam) y los núcleos se marcaron con DAPI (dilución 1:500) (Sigma). El experimento de captación de FM1-43 se realizó utilizando FM1-43FX, un análogo fijable de la tinción de membrana FM1-43 (dilución 1:500) (Invitrogen).

La cóclea se perfundió inmediatamente con paraformaldehído al 4% después de anestesiar al ratón. A continuación, los tejidos se sumergieron en glutaraldehído al 2,5 % para SEM. Las muestras SEM se fijaron posteriormente en OsO4 tamponado con fosfato al 1 %, se deshidrataron en una serie graduada de etanol, se secaron, se montaron sobre una lámina de aluminio y se rociaron con oro/paladio. SEM se realizó utilizando un ZEISS GeminiSEM 300 (Alemania). Las fotos se muestran en pseudo-color.

Evaluar las funciones de los HC nativos en ratones WT y los HC recién generados en Mst1fl/fl/Mst2fl/fl; Sox9-CreERT2/+; Ratones Rosa26-tdTomato/+, realizamos grabaciones patch-clamp en órganos extirpados de Corti. Para estos experimentos electrofisiológicos, las cócleas de ratones P7 WT o ratones transgénicos se disecaron recientemente en DMEM/F12 y luego se bañaron en una solución extracelular que contenía (en mM): 135 NaCl, 5,8 KCl, 1,3 CaCl2, 0,9 MgCl2, 0,7 NaH2PO4⋅H2O, 10 HEPES, 5,6 D-glucosa, 2 Na-piruvato (309 mOsm, el pH se ajustó a 7,40 con NaOH). A continuación, las vueltas apicales y medias de la cóclea se inmovilizaron en el cristal con cell-TeK (Sigma) y se transfirieron a la cámara de registro. Se seleccionaron para el registro OHC nativos aleatorios, SC cerca de los IHC y HC regenerados en el giro apical.

Las grabaciones de patch-clamp de células enteras se realizaron utilizando el software Patchmaster (HEKA Electronics) y el amplificador EPC10/2 (HEKA Electronics, Lambrecht Pfalz, Alemania). Se extrajeron pipetas de parche de 3 a 5 MΩ de capilares de vidrio de borosilicato (Sutter). La solución de llenado de la pipeta contenía (en mM): 112 K-metanosulfonato, 20 KCl, 10 HEPES, 2 ácido tetraacético de etilenglicol, 10 Na-fosfocreatina, 3 Mg-ATP, 0,5 Na-GTP (285 mOsm, el pH se ajustó a 7,40 con KOH). Los especímenes se observaron en un microscopio vertical (Olympus) con óptica de contraste de interferencia diferencial Nomarski (objetivos de inmersión en agua de 60x).

Las celdas se mantuvieron a -80 mV para la fijación de voltaje, y para el registro de corriente de K+ total usamos pasos de voltaje de -120 mV a +50 mV a 10 mV por paso. Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente y los voltajes se corrigieron fuera de línea para un potencial de unión líquida medido de 6 mV (K interno).

Los datos de electrofisiología se analizaron con el software Igor (Pro 6.22) y GraphPad Prism6. Para el análisis de corriente K+, los datos se aceptaron si Rs no era superior a 20 MΩ. Los datos se informan como medias ± SEM.

Se recolectaron de seis a ocho cócleas cultivadas para aislar el ARN total utilizando el AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit (QIAGEN) como se informó en el estudio anterior32.

El procesamiento preliminar de las lecturas sin procesar se realizó con Casava 1.8 (Illumina), y los adaptadores y las bases de baja calidad se recortaron con trimmomatic (versión 0.23). Las lecturas recortadas de cada muestra se alinearon con el genoma de Mus musculus UCSC mm10 utilizando Hisat250. Las lecturas alineadas se contaron con HTseq (doi:10.1093/bioinformatics/btu638) según la anotación UCSC mm10. El análisis de expresión diferencial entre condiciones se realizó utilizando el paquete DESeq2 R (Love et al., 2014). Se consideró que los genes con un valor de p ajustado (padj) <0,05 y un cambio de pliegue >1,5 se expresaban diferencialmente. El análisis de ontología génica de genes expresados ​​diferencialmente de forma significativa se realizó con DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp). Se utilizó el paquete Pheatmap R para generar mapas de calor. El análisis de red de interacción proteína-proteína (PPI) de genes expresados ​​diferencialmente en las vías de señalización Hippo, Notch y Wnt se realizó utilizando el software STRING.

En el análisis de enriquecimiento funcional. El punto de corte de 0,1 para la tasa de falsos descubrimientos se utilizó para incluir más vías potencialmente involucradas.

La proteína total de la cóclea se aisló con tampón de lisis RIPA (Beyotime) suplementado con PMSF (Beyotime). Las concentraciones de proteínas se midieron con un kit de ensayo de proteínas BCA (Beyotime) y las proteínas se separaron en un gel PAGE prefabricado BeyoGel™ Plus para el sistema Tris-Gly (Beyotime) y se transfirieron a membranas de difluoruro de polivinilideno (Beyotime). Las membranas se bloquearon con leche en polvo sin grasa al 10 % en solución salina tamponada con Tris con Tween 20 (TBST, Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), NaCl 150 mM y Tween 20 al 0,1 %) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se secaron. durante la noche con anticuerpos primarios a 4 ° C. Los anticuerpos primarios fueron los siguientes: conejo anti-Yap (dilución 1:1000) (CST), conejo anti-fosfo-Yap (dilución 1:1000) (Ser127) (CST), conejo anti-LATS1 (dilución 1:1000) (CST), anti-fosfo-LATS1 de conejo (dilución 1:1000) (Thr1079) (CST), anti-Cyr61 de conejo (dilución 1:500) (Santa Cruz) y anti-CTGF de cabra (dilución 1:500) ( Santa Cruz). Todos los blots derivan del mismo experimento y fueron procesados ​​en paralelo.

Se utilizó un microscopio confocal SP8 para adquirir imágenes fluorescentes. Todas las imágenes se etiquetaron y procesaron digitalmente con ImageJ, Adobe Photoshop CS6 e Illustrator CC. El diagrama esquemático se dibujó utilizando el software CDR. Los recuentos de células en las imágenes fluorescentes se realizaron utilizando ImageJ. Se contaron los números totales de HC, SC, células EdU+ y células con doble tinción en regiones de 200 µm de la cóclea desde los giros apical, medio y basal.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software GraphPad Prism. Se usaron pruebas t de una muestra y pruebas t de Student no pareadas de dos colas para determinar la significación estadística al comparar dos grupos, y ANOVA de una y dos vías cuando se compararon más de dos grupos. Un valor de p < 0,05 fue estadísticamente significativo. Los datos se muestran como la media ± SEM.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable. Los datos del análisis de secuenciación de ARN se han depositado en el depósito de la base de datos pública GEO (número de acceso GSE213784).

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Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (No. 2017YFA0103900), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nos. 82192860, 81830029, 81900931, 81970879), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de Shanghái (21ZR1411800), el Programa de Excelentes Médicos-Excelentes Investigadores Clínicos (Nos. SYB202008, SZA202002), el "Programa de Navegación" (19YF1406000) y los Proyectos de Investigación del Comité Municipal de Salud de Shanghái (2020YJZX0110, 2022XD059).

Estos autores contribuyeron por igual: Xiaoling Lu, Huiqian Yu, Jiaoyao Ma, Kunkun Wang.

Instituto ENT y Departamento de Otorrinolaringología, Hospital Oftalmológico y ENT, Laboratorio Estatal Clave de Neurobiología Médica y Centro de Fronteras del Ministerio de Educación para la Ciencia del Cerebro, Laboratorio Clave de Medicina Auditiva del NHC (Universidad de Fudan), Universidad de Fudan, 200031, Shanghái, República Popular China

Xiaoling Lu, Huiqian Yu, Jiaoyao Ma, Kunkun Wang, Luo Guo, Yanping Zhang, Huawei Li y Shan Sun

Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Xiamen, 361100, Xiamen, República Popular China

Boan Li y Zehang Zhao

Institutos de Ciencias Biomédicas, Universidad de Fudan, 200032, Shanghái, República Popular China

huawei li

Los Institutos de Ciencias del Cerebro y el Centro de Innovación Colaborativa para la Ciencia del Cerebro, Universidad de Fudan, 200032, Shanghái, China

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HL y SS diseñaron los estudios; XL, HY, KW, JM e YZ realizaron los experimentos; XL, KW y HY adquirieron los datos; XL, HY, LG y SS analizaron los datos; HL proporcionó reactivos; y XL, HY y SS escribieron el manuscrito. XL, HY, JM y KW contribuyeron igualmente a este trabajo.

Correspondencia con Huiqian Yu, Huawei Li o Shan Sun.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Lu , X. , Yu , H. , Ma , J. et al. La pérdida de actividad de Mst1/2 promueve la generación de células ciliadas no mitóticas en el órgano neonatal de Corti. npj Regen Med 7, 64 (2022). https://doi.org/10.1038/s41536-022-00261-4

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Recibido: 17 enero 2022

Aceptado: 10 de octubre de 2022

Publicado: 25 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41536-022-00261-4

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