El proteoma de los haces de pelo vestibular del ratón durante el desarrollo

Jul 17, 2023

Scientific Data volumen 2, Número de artículo: 150047 (2015) Citar este artículo

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Detalles de métricas

El desarrollo del haz de pelo de los vertebrados es un evento orquestado con precisión que culmina en la producción de una disposición estrechamente ordenada de estereocilios ricos en actina y un solo cinocilio axonemal. Para comprender cómo cambia la composición proteica del paquete durante el desarrollo, aislamos paquetes de utrículos de ratón jóvenes (días posnatales P4-P6) y maduros (P21-P25) utilizando el método de torsión, luego caracterizamos sus proteínas constituyentes mediante cromatografía líquida. espectrometría de masas en tándem con adquisición dependiente de datos. Usando MaxQuant y la cuantificación sin etiquetas, medimos la abundancia relativa de proteínas en ambos paquetes y en todo el utrículo; la comparación de la abundancia de proteínas entre las dos fracciones permite el cálculo del enriquecimiento en paquetes. Estos datos, que están disponibles a través de ProteomeXchange con el identificador PXD002167, serán útiles para examinar las proteínas presentes en los haces vestibulares de los mamíferos y cómo cambian sus concentraciones a lo largo del desarrollo.

Tipos de diseño

diseño de grupos paralelos • diseño de réplicas • diseño de desarrollo de organismos

Tipo(s) de medición

perfil de expresión de proteínas

Tipos de tecnología

ensayo de espectrometría de masas

Tipo(s) de factor(es)

Etapa del ciclo de la vida

Características de la muestra

Mus musculus • utrículo del laberinto membranoso

Archivo de metadatos accesible por máquina que describe los datos informados (formato ISA-Tab)

El haz de pelo de los vertebrados, el orgánulo sensorial del oído interno, es necesario para la mecanotransducción, que es el proceso de convertir señales mecánicas como el sonido y el movimiento de la cabeza en excitación eléctrica en el sistema nervioso. El haz, que sobresale de la superficie apical de una célula ciliada sensorial, se compone de docenas a cientos de estereocilios llenos de actina y un solo cilio axonemal verdadero, el kinocilium1. El conocimiento de la composición del paquete es necesario para comprender cómo funciona el paquete y cómo se ensambla. La espectrometría de masas se ha convertido en el mejor método de alto rendimiento para caracterizar su composición proteica. Si bien tenemos una excelente comprensión del proteoma de los mechones de pelo vestibular de pollo2, así como una visión más limitada de los mechones de cóclea de pollo3, la determinación de la composición proteica de los mechones de pelo de ratón es un siguiente paso esencial. El oído interno del ratón no solo es un modelo excepcional para estudiar la sordera humana y los trastornos del equilibrio, sino que las muchas herramientas genéticas y moleculares disponibles para el ratón hacen posible muchos experimentos que no se pueden llevar a cabo en otros organismos. Además, se sabe relativamente poco acerca de cómo cambia la composición proteica del paquete durante el desarrollo; por ejemplo, las proteínas que controlan pasos clave en el alargamiento de los estereocilios solo pueden encontrarse en haces jóvenes.

Los mechones de pelo son escasos; hay solo unos pocos miles de células ciliadas en cada órgano auditivo o vestibular, y en el pollo (y el ratón; ver más abajo), los haces representan menos del 1% de la proteína total en el órgano2. Solo ~2 ng de actina están presentes en los haces de un utrículo de ratón4, y la actina representa >50 % de la proteína total del haz (ver más abajo). Además, muchas de las moléculas más interesantes de los estereocilios están presentes en una abundancia molar <10−5 de la actina, menos de un átomo por oreja. Por lo tanto, los experimentos bioquímicos para caracterizar el proteoma del paquete requieren una disección extensa, métodos de purificación especializados y el uso de metodologías de detección sensibles.

La espectrometría de masas de proteínas se ha convertido en la única técnica con la sensibilidad y el rango dinámico para analizar una amplia gama de proteínas de los mechones de cabello. Si bien es probable que los métodos de arriba hacia abajo5 e independientes de los datos6 para el análisis de proteínas se desarrollen lo suficiente para el análisis de las proteínas del paquete en el futuro, en la actualidad, la espectrometría de masas de escopeta dependiente de los datos7 ofrece un enfoque bien caracterizado que permite la detección de proteínas de bajo y alto nivel. abundancia de proteínas, aunque en última instancia limitada por el rango dinámico de los espectrómetros de masas. Además, los métodos para cuantificar proteínas utilizando datos de espectrometría de masas han mejorado, lo que permite una medición precisa de la abundancia relativa de proteínas utilizando intensidades de iones originales o secundarios8,9. Juntas, estas técnicas permiten una caracterización completa del proteoma del haz de cabello.

Utilizamos la técnica de purificación de mechones de cabello twist-off10, que captura mechones en una matriz de gel de agarosa, para aislar mechones de ratón de los utrículos, uno de los órganos vestibulares (Fig. 1a, b). Se recogieron cuatro réplicas biológicas de haces, cada una de 100 orejas, de ratones inmaduros (~P5) y adultos jóvenes (~P23). Las proteínas del paquete purificadas se sometieron a cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) utilizando un espectrómetro de masas Orbitrap. Para proporcionar una referencia para examinar el enriquecimiento del paquete, también analizamos cuatro réplicas biológicas de 10 utrículos de ratón en cada una de las mismas dos etapas de desarrollo. Identificamos proteínas con el motor de búsqueda de Andrómeda y las cuantificamos mediante mediciones sin etiquetas de la intensidad del péptido precursor. Al comparar la abundancia relativa de cada proteína identificada tanto en los haces como en el utrículo, pudimos determinar el enriquecimiento de la proteína en los haces de cabello.

(a) Relleno de pintura del oído interno del ratón, con los parches sensoriales marcados ('utr', utrículo; 'a', ampollas de los canales semicirculares; 'sac', sáculo; 'coch', cóclea). Adaptado de la Fig. 1b de la ref. 22 con permiso. ( b ) Tinción de faloidina (para detectar actina) de una región de ~ 50 × 50 μm del epitelio utricular (~ 100 células ciliadas, de ~ 3000). Se observan haces de cabello saliendo del epitelio sensorial utricular, que está marcado por cinturones de actina circunferenciales que rodean cada célula. (c) Flujo de trabajo. Se prepararon cuatro réplicas biológicas de cada uno de los haces P5 (BUN), haces P23, utrículos P5 (UTR) y utrículos P23. De las muestras del paquete, ~10% de la proteína derivada del utrículo; los haces constituyen <1% de la proteína en la muestra del utrículo. Las proteínas de cada una de las dieciséis muestras se separaron usando ciclos cortos de SDS-PAGE, y los carriles se cortaron en seis piezas cada uno. Las muestras se redujeron, alquilaron y sometieron a digestión con tripsina antes de LC-MS/MS. En el proyecto se llevaron a cabo un total de 96 ciclos de LC-MS/MS. Los péptidos de cada ejecución se identificaron utilizando MaxQuant; los datos de las seis rebanadas de gel por proteína se combinaron de nuevo para que el resultado final representara todos los péptidos detectados a partir de la única réplica biológica. MaxQuant agrupó todas las proteínas que no se distinguían por péptidos únicos; nuestra agrupación adicional reunió a todas las proteínas que compartían al menos el 20 % de sus péptidos. ( d ) Paquetes de cabello de utrículo de ratón purificados teñidos con faloidina para detectar actina (magenta) y DAPI para detectar núcleos (verde). Tanto los paquetes como las áreas de contaminación celular sustancial se pueden ver en el microscopio de disección, y las regiones contaminantes se pueden cortar de los paquetes. Para la preparación que se muestra, el área que sería extirpada se indica mediante líneas discontinuas. Nótese que quedaría algo de contaminación nuclear (flechas). ( e ) Inmunotransferencia de proteínas utilizada para estimar la contaminación en preparaciones de paquetes de ratones. Se corrió el número indicado de equivalentes de oreja de haces (izquierda) o epitelios utriculares (derecha). El panel superior es la mancha de tinta china de la transferencia después de la transferencia de proteínas; obsérvense las bandas correspondientes a actina y queratina contaminante en el carril de haces. Los dos paneles inferiores son inmunotransferencias de proteínas. Incluso con material equivalente a 15 orejas, el marcador de membrana plasmática Na+/K+-ATPasa y la proteína de filamento intermedio vimentina no se detectaron en la preparación del haz.

Recolectamos cuatro conjuntos de muestras, que incluían mechones de pelo de ratón purificados de ratones postnatales de 4 a 6 días (denominados 'P5') y utrículos P21-P25 ('P23'), así como utrículos de las mismas edades (Tabla 1 ). Las muestras de paquetes se denominan 'BUN'; están moderadamente contaminados por cuerpos celulares. Las muestras de utrículo se denominan 'UTR'; también contienen mechones de cabello, aunque en <1% de la proteína total (Fig. 1 complementaria). Se prepararon cuatro réplicas biológicas para cada una de las cuatro condiciones. Las proteínas se separaron parcialmente mediante SDS-PAGE y luego se digirieron en péptidos. Se usó LC-MS/MS para identificar y cuantificar péptidos de las cuatro condiciones. Utilizamos MaxQuant8, con su motor de búsqueda integrado Andromeda11, para hacer coincidir los péptidos con las entradas de la base de datos de proteínas de ratón, para ensamblar péptidos en proteínas y cuantificar esas proteínas. El flujo de trabajo para el aislamiento de paquetes, la preparación de muestras, la espectrometría de masas y el análisis de datos se muestra en la Fig. 1c. La información sobre la configuración del instrumento del espectrómetro de masas, la búsqueda en la base de datos, el mapeo de péptido a proteína y la cuantificación (que cumple con los requisitos de Información mínima sobre un experimento de proteómica [MIAPE]12) se presenta en la Tabla complementaria 1.

Los mechones de cabello se purificaron mediante el método twist-off2,4,10,13,14; los métodos se describen en detalle en la ref. 14. Se diseccionaron máculas de utrículo de ratones CD-1 en P4-P6 (utrículo en desarrollo) o P21-P25 (adulto joven). Los métodos para diseccionar utrículos de ratón se han presentado en otro lugar15,16. Las máculas se adhirieron al fondo sin tratar de una placa de plástico de 35 mm (placas Petri Falcon EASY GRIP; Becton Dickinson) en medio L-15 de Leibovitz sin rojo fenol (21083-027; Thermo Life Technologies). Las membranas otolíticas se retiraron con una pestaña. Se colocó una arandela de plástico alrededor de las máculas en la placa y la preparación se inundó con agarosa de bajo punto de fusión al 4,5 % (filtrada a través de un filtro de 5 μm) a 42 °C. Se permitió que la agarosa se endureciera hasta formar un gel firme a 4 °C, luego se colocó el disco de agarosa formado por el anillo en una plataforma de perfusión bajo un microscopio de disección. Bajo flujo constante con L15, se eliminaron las máculas, dejando mechones de cabello atrapados en la agarosa. Se usó un bisturí pequeño o una aguja de tungsteno para eliminar los desechos celulares obvios (Fig. 1b), luego se extrajeron los paquetes de un solo utrículo en un tapón de agarosa de volumen mínimo (<0.5 μl). Los paquetes aislados en agarosa se congelaron a -80 ° C en tubos de microcentrífuga de baja unión a proteínas. Las muestras de paquetes se agruparon más tarde para el análisis de espectrometría de masas.

Para el análisis de la mácula utricular completa, se diseccionó el utrículo para eliminar todo el tejido fuera de la región del epitelio sensorial y se eliminó la membrana otolítica. A diferencia de nuestros análisis anteriores de utrículos de pollo2,17, donde pelamos el epitelio sensorial de la membrana basal y el tejido conectivo, aquí analizamos utrículos de ratón enteros sin pelar. El epitelio sensorial del utrículo de ratón no se desprende fácilmente del estroma sin un tratamiento con proteasa (p. ej., colagenasa o termolisina). Además de las proteínas de las células ciliadas y de las células de apoyo, la preparación contenía así proteínas derivadas de la matriz extracelular, el estroma y los nervios.

Para examinar mechones de cabello aislados mediante microscopía de fluorescencia, el disco de agarosa que contenía mechones de cabello aislados limpios se lavó en medio L15 en una placa de 12 pocillos. Luego, el disco de agarosa se transfirió a formaldehído al 4 % en PBS y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente. Después de lavar 2 veces con PBS, los discos se almacenaron a 4 °C durante la noche. Al día siguiente, los paquetes se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,5 % en PBS durante 10 min y luego se transfirieron a 13 nM (1:500 de stock de 6,6 μM) Alexa Fluor 488 Phalloidin (Life Technologies) y 1:10 000 DAPI (Sigma ) en PBS durante 2-3 h. Los discos se enjuagaron 3 veces en PBS, luego se retiraron los paquetes en agarosa del disco en una losa delgada. Después de colocarla en un portaobjetos, la muestra se revistió con medio de montaje VECTASHIELD (Vector Laboratories) y se cubrió con cubreobjetos.

Para la caracterización de inmunotransferencia, se recolectaron mechones de pelo de ratón y utrículos de ratones P21-25 como se describe para los experimentos de espectrometría de masas. Las proteínas del haz y del utrículo se solubilizaron con tampón de muestra NuPAGE LDS reductor (Invitrogen); las muestras se calentaron a 65 °C durante 15 min, luego a 95 °C durante 5 min, y se separaron pasándolas a un gel NuPAGE 4–12 % Bis-Tris (1,5 mm × 10 pocillos; Invitrogen). Las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore) siguiendo procedimientos estándar. La membrana se enjuagó con agua y PBS/Tween-20 al 0,1 % (PBST) y luego se tiñó durante 30 min con tinta Black Indian (Windsor & Newton) diluida 1:5000 en PBST. A continuación, la membrana se bloqueó durante 1 h en el reactivo de bloqueo principal ECL de Amersham (GE Healthcare) y se incubó durante la noche a 4 °C con anticuerpos primarios del Developmental Studies Hybridoma Bank (anti-vimentina, #AMF-17b; ATPasa, anti-Na(+ ) Subunidad alfa K(+), #a5) diluida 1:1,000 en reactivo de bloqueo. Después de lavados de 5x6 min en PBST, la membrana se incubó durante 1 ha temperatura ambiente en anticuerpos secundarios (HRP de cabra anti-conejo y HRP de cabra anti-ratón) diluidos 1:10.000 en reactivo de bloqueo. Las bandas se visualizaron utilizando el reactivo SuperSignal Pico West ECL (Thermo Scientific).

Para eliminar los polímeros que interfieren de la agarosa utilizada para el aislamiento del haz, separamos las proteínas mediante un SDS-PAGE breve antes de la reducción, la alquilación y la digestión con tripsina2,18. Las proteínas del utrículo también se separaron por SDS-PAGE. Para preparar las muestras, se añadió 1,2x de tampón de muestra NuPAGE LDS (Invitrogen) con ditiotreitol 50 mM a un volumen final combinado de 40–60 μl por 100 utrículos de paquetes; el volumen varió de una muestra a otra dependiendo de la cantidad de agarosa con la que se escindieron los paquetes. Las proteínas del utrículo también se solubilizaron con tampón de muestra NuPAGE LDS (40 μl por 10 utrículos). Las muestras se calentaron a 65 °C durante 15 min, luego a 95 °C durante 5 min. Las proteínas se separaron introduciendo ~1 cm en un gel NuPAGE Bis-Tris al 4–12 % (1,5 mm x 10 pocillos; Invitrogen); se utilizó un carril para muestras de <50 μl y dos carriles para muestras de >50 μl. Los geles se enjuagaron con agua, luego se tiñeron durante 5 h con Imperial Protein Stain a temperatura ambiente (Thermo Scientific). Después de enjuagar con agua a 4 °C durante 5 h, 1 cm de gel con proteínas separadas se cortó manualmente en seis piezas, cada una de las cuales se procesó por separado en los pasos posteriores.

Las piezas de gel se transfirieron a tubos siliconados, luego se lavaron con 200 μl de agua de grado HPLC (agitación vorticial 30 s), 200 μl de NH4HCO3 50 mM al 50 %/MeOH al 50 % (agitación vorticial 1 min), 200 μl de NH4HCO3 50 % al 50 % /acetonitrilo al 50 % (agitado 5 min) y 200 μl de acetonitrilo al 100 % (agitado 30 s). Se eliminó la solución restante y las piezas de gel se secaron brevemente en un concentrador de vacío SpeedVac; se almacenaron durante la noche a -20 °C.

Las piezas de gel se rehidrataron con 100 μl de DTT 25 mM recién hecho en NH4HCO3 50 mM, luego se incubaron durante 20 min a 56 °C. Se descartó el sobrenadante y se añadieron 100 μl de yodoacetamida 55 mM en NH4HCO3 50 mM; esta solución se incubó con las piezas de gel en la oscuridad durante 20 min a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante y las piezas de gel se lavaron dos veces con 400 μl de agua de grado HPLC. Los lavados se desecharon y se añadieron 200 μl de NH4HCO3 50 mM al 50 %/acetonitrilo al 50 % (agitado 5 min). Este lavado se descartó y se añadieron 200 μl de acetonitrilo al 100 % (agitado en vórtex durante 1 min). Se descartó el sobrenadante y las muestras se secaron en SpeedVac durante 2-3 min.

Encontramos que la digestión en ProteaseMAX Surfactant-Trypsin Enhancer (Promega) aumentó sustancialmente la recuperación de los péptidos del cabello. Se preparó una solución al 1 % de ProteaseMAX añadiendo 100 μl de NH4HCO3 50 mM a la alícuota madre con agitación para mezclar; esta solución de ProteaseMAX se mantuvo en hielo. Se preparó una alícuota de 1,5 ml de ProteaseMAX al 0,01 % añadiendo 15 μl de ProteaseMAX al 1 % a 1485 μl de NH4HCO3 50 mM. Se preparó una alícuota de 1,5 ml de ProteaseMAX al 0,01 %/6 ng μl−1 de tripsina añadiendo 15 μl de ProteaseMAX al 1 % a 1440 μl de NH4HCO3 50 mM; la solución se mezcló, luego se añadieron 45 μl de un stock de tripsina de 200 ng μl−1 (grado proteómico Sigma-Aldrich T6567, de páncreas porcino, dimetilado), diluido fresco en NH4HCO3 50 mM. A cada pieza de gel se le añadieron 30 μl de la solución de tripsina ProteaseMAX al 0,01 %/6 ng μl−1 y se incubó durante 30 min a 4 °C. Las piezas de gel se cubrieron con 20 μl de la solución ProteaseMAX al 0,01 % para mantenerlas completamente sumergidas. Se permitió que prosiguiera la digestión con tripsina durante 3 horas a 37 °C.

La solución de digestión se transfirió a tubos nuevos (25 a 40 μl de líquido de cada tubo) y las muestras se combinaron si se habían dividido las piezas originales del gel; Se añadieron 30 μl de ácido trifluoroacético al 2,5 % (en agua de grado HPLC) a las piezas de gel (agitadas en vórtex durante 15 min). La solución se eliminó y se combinó con la solución de digestión inicial. La solución se agitó y luego la solución combinada se centrifugó durante 10 min a 14.000 rpm en una microcentrífuga. El sobrenadante se transfirió a tubos de filtro de 0,45 μm (filtros centrífugos Millipore Ultrafree, #UFC0HV00); las muestras se centrifugaron durante 5 min a 4000 rpm. Todas las muestras se secaron en SpeedVac hasta que se evaporó prácticamente toda la solución (~2 h), luego se almacenaron a -80 °C antes de la espectrometría de masas.

Se analizó el valor de un solo experimento de mechones de cabello o utrículo utilizando seis ejecuciones de LC-MS/MS, correspondientes a las seis piezas de gel. El sistema LC-MS/MS constaba de un espectrómetro de masas Thermo Electron Orbitrap Velos ETD y una fuente de iones de nanospray Protana, que se interconectaba con una columna capilar de fase inversa de 8 cm de longitud × 75 μm de diámetro interno, autoempaquetada con Phenomenex C18 Júpiter de tamaño de partícula de 10 μm. Las muestras se llevaron a 15 µl de acetonitrilo al 50 %/ácido fórmico al 5 %; Se inyectaron 7,5 μl y los péptidos se eluyeron de la columna mediante un gradiente de acetonitrilo/ácido acético 0,1 M a un caudal de 0,5 μl min−1 durante 1,2 h. La fuente de iones de nanopulverización se hizo funcionar a 2,5 kV. El resumen se analizó usando la capacidad dependiente de datos del instrumento, adquiriendo en escaneos secuenciales (1) un espectro de masas de escaneo completo único en el detector Orbitrap a una resolución de 60,000 para determinar el péptido m/z y las intensidades, y (2) 20 espectros de iones en la trampa de iones, que nos permiten hacer coincidir los péptidos con la base de datos.

Se utilizó el software MaxQuant versión 1.5.1.2 para la identificación y cuantificación de proteínas8. El archivo de contaminantes predeterminado asociado con la descarga de MaxQuant se editó para eliminar las entradas que se sabe que están presentes en los paquetes de cabello (p. ej., actina) y para agregar impurezas adicionales que ingresaron al flujo de trabajo de purificación del paquete (p. ej., queratinas, hemoglobinas). Los datos de espectrometría de masas se buscaron en la versión de Ensembl GRCm38_71 (lanzada en abril de 2013) usando Andromeda11; el archivo Ensembl FASTA se complementó con productos de empalme alternativos Xirp2 recientemente determinados19. No se utilizó 'coincidencia entre ejecuciones'. Las identificaciones de proteínas se informaron con una tasa de descubrimiento falso (FDR) del 1%.

Usamos MaxQuant para calcular iBAQ, una medida de la abundancia de proteínas. El valor iBAQ se obtiene dividiendo las intensidades de proteína por el número de péptidos trípticos teóricamente observables entre 6 y 30 aminoácidos20, y en promedio está altamente correlacionado con la abundancia de proteína9,20.

Escribimos un programa Mathematica versión 10 para procesar aún más el archivo MaxQuant 'proteinGroups.txt'. Este programa (1) reemplazó los nombres y símbolos de proteínas predeterminados con entradas definidas por el usuario, (2) eliminó todas las entradas marcadas por MaxQuant como 'Posible contaminante' o 'Reversa' (las proteínas etiquetadas como 'Solo identificadas por sitio' se mantuvieron, ( 3) agrupó proteínas que comparten >20% de sus péptidos y (4) preparó un archivo de salida.

El archivo de salida se importó a Excel, donde (5) calculamos el iBAQ relativo (riBAQ)2,9, que es el iBAQ para una proteína o grupo de proteínas (calculado por MaxQuant) dividido por todos los valores iBAQ no invertidos y no contaminantes para una réplica, (6) se determinaron las medias y las desviaciones estándar para cada condición experimental, (7) se calcularon las proporciones de haz a utrículo determinadas para cada edad de desarrollo, y (8) se calcularon las relaciones P5 a P23 para haces y utrículos. .

El código personalizado de Mathematica que toma la salida de MaxQuant y agrupa las proteínas relacionadas está disponible en el conjunto de datos de ProteomeXchange (PXD002167).

Todos los archivos de datos y análisis, que se describen a continuación, se han depositado en el depósito de ProteomeXchange (número de acceso PXD002167; http://www.proteomexchange.org). Este conjunto de datos incluye 96 archivos RAW, que representan datos de LC-MS/MS de las cuatro condiciones experimentales (paquetes P5, utrículo P5, paquetes P23, utrículo P23) representados por cuatro réplicas biológicas analizadas en seis ejecuciones, una para cada porción de gel (Datos Cita 1). El conjunto de datos también incluye 'SEARCH_MAXQUANT.zip', que contiene todos los archivos MaxQuant de la carpeta 'txt', así como el archivo 'experimentalDesignTemplate.txt' que especifica cómo MaxQuant debe buscar los archivos (Cita de datos 1) . El archivo FASTA utilizado para la búsqueda de MaxQuant se incluye como 'OTHER_FASTA.zip' (cita de datos 1), y los programas, el archivo de entrada y las salidas de Mathematica se encuentran juntos como 'OTHER_MATHEMATICA.zip' (cita de datos 1). Finalmente, el archivo más importante para los lectores que no estén interesados ​​en volver a analizar los datos es 'S1 Mouse P4-P21 data Orbitrap-MaxQuant 2015-05-29c.xls', comprimido en el registro de datos como 'OTHER_EXCEL_FINAL.zip' (cita de datos 1) ; este es el archivo de Excel que contiene los datos promediados para cada proteína bajo cada condición experimental. Esta tabla se replica aquí como Tabla complementaria 2.

La utilidad del conjunto de datos del paquete de cabello depende de la capacidad de ignorar las proteínas presentes en las muestras del paquete que surgieron de la contaminación de los cuerpos celulares; las disecciones rara vez son perfectas. Se puede eliminar parte del tejido dañado después de examinar cada preparación con un microscopio de disección e iluminación de campo oscuro; luego podemos diseccionar la contaminación más notoria y obvia (Fig. 1d). No obstante, las muestras de mechones aislados todavía tienen niveles significativos de proteínas de estructuras que se sabe que no están presentes en mechones de cabello, por ejemplo, núcleos y mitocondrias.

Evaluamos la pureza de la preparación del haz de cabello determinando la abundancia relativa de histonas tanto en los haces como en el utrículo (Tabla 2); ya que las proteínas nucleares deben estar ausentes de los paquetes. La proporción de BUN/UTR para histonas representa la fracción de proteína presente en BUN que originalmente se derivó de los utrículos. Mediante el uso de entradas de histonas que se detectaron en 4/4 ejecuciones de BUN y 4/4 ejecuciones de UTR, determinamos que la muestra de P5 BUN tenía ~97 % de paquetes y que la muestra de P23 BUN tenía ~84 % de paquetes. Los valores de enriquecimiento para las dos edades (0,033±0,027 y 0,16±0,10) se pueden utilizar para probar estadísticamente el enriquecimiento significativo de proteínas en paquetes por encima de estos niveles de fondo.

Además, también evaluamos la pureza mediante la realización de inmunotransferencias de muestras de mechones de cabello con anticuerpos contra proteínas que se sabe que están ausentes en los mechones (Fig. 1e). Utilizando muestras P23, las señales de haz de Na+/K+-ATPasa y vimentina estaban por debajo del límite de detección en estos ensayos. Sin embargo, estas eran preparaciones separadas de las analizadas por espectrometría de masas; el análisis de histonas de los datos de espectrometría de masas P5 y P23 son más relevantes para evaluar la contaminación en esas preparaciones.

Se utilizaron cuatro réplicas biológicas para las cuatro condiciones (P5 BUN y UTR, P23 BUN y UTR). Los diagramas de caja que muestran la distribución de los valores de riBAQ para cada una de las 16 muestras se muestran en la Fig. 2a. En la Fig. 2b se muestra un gráfico de dispersión matricial con comparaciones por pares de todas las muestras. Tenga en cuenta que las muestras biológicas replicadas mostraron los coeficientes de correlación de Pearson más altos (números en recuadros). De manera similar, el análisis de componentes principales mostró que cada uno de los cuatro conjuntos de muestras se distinguía claramente entre sí (Fig. 2c, d). PC1 representó más del 90% de la varianza. Las muestras de paquetes mostraron la mayor separación en PC2 y las muestras de utrículo en PC3. Juntos, los resultados en la Fig. 2 muestran que las réplicas para cada condición experimental fueron lo suficientemente similares como para que pudieran combinarse.

(a) Diagramas de caja que muestran los valores de riBAQ para todas las proteínas en las muestras indicadas. ( b ) Gráfico de dispersión de matriz que muestra comparaciones por pares de proteínas detectadas en cada una de las dos muestras. Líneas rojas, suavizado LOESS de datos. Los números en el lado derecho/superior de la diagonal son los valores absolutos de los coeficientes de correlación de Pearson. Tenga en cuenta las correlaciones más altas para las réplicas biológicas (fondo de color). ( c, d ) Análisis de componentes principales de las 16 muestras. En (c), PC1 (91 % de varianza) se grafica contra PC2 (5 % de varianza). En (d), PC2 se grafica contra PC3 (2% de varianza).

El número de proteínas identificadas en haces y epitelio en cada edad se indica en la Fig. 3a. La distribución de los valores de riBAQ para las proteínas del utrículo fue muy similar en P5 en comparación con P23 (Fig. 3b). La distribución de las relaciones log P5/P23 para cada proteína se centró alrededor de 0, lo que muestra que la mayoría de las proteínas cambiaron poco sus niveles de expresión entre P5 y P23 (Fig. 3c). Como reflejo del menor número de proteínas identificadas, la distribución de las proteínas del paquete de proteínas riBAQ tenía una amplitud reducida y también parecía ser un cambio hacia proteínas más abundantes (Fig. 3d), que era más evidente cuando solo las proteínas se enriquecían en paquetes en el 0.45 o mayor nivel fueron trazados (Fig. 3e). La mayoría de las proteínas detectadas en los paquetes fueron más abundantes en P23 que en P5 (Fig. 3f). Juntos, estos datos sugieren que un número menor de proteínas abundantes dominaba la muestra del paquete en P5 y que, durante el desarrollo, el proteoma del paquete se volvió más complejo.

( a ) Diagrama de Venn que muestra el número de proteínas o grupos de proteínas identificados en haces y muestras de utrículo. Solo se identificó un pequeño número de proteínas en el paquete. ( b ) Distribución de log10 de valores promedio de proteína riBAQ para muestras de utrículo. Solo se incluyeron proteínas detectadas a partir de tres o más muestras. ( c ) Distribución de los valores de riBAQ para cada proteína del utrículo en P5 y P23. El ajuste es un solo gaussiano (pico en +0,2). ( d ) Distribución de log10 de moléculas de proteína promedio por valores de estereocilio para muestras de paquetes. Los valores de riBAQ se convirtieron en moléculas por estereocilio suponiendo que riBAQ midió con precisión la abundancia fraccional de proteína y que la actina estaba presente en 400 000 moléculas por estereocilio2,9. Solo se incluyeron proteínas detectadas a partir de tres o más muestras. (e) Igual que (d) excepto que solo se incluyeron proteínas con un enriquecimiento de BUN/UTR de 0,45 o mayor. ( f ) Distribución de los valores de riBAQ para cada proteína del paquete en P5 y P23. El ajuste es un solo gaussiano (pico en −0,6). ( g ) Valores totales de iBAQ como proxy de proteína total. Primero se eliminaron los contaminantes y las entradas invertidas. Las muestras de utrículos P5 y P23 fueron similares, pero hubo 1,7 veces más señal iBAQ en la muestra del paquete P23 en comparación con P5.

Como se señaló anteriormente, aunque se identificaron números similares de proteínas en los utrículos P5 y P23, se identificaron menos de la mitad de las proteínas en los paquetes P5 que en los paquetes P23 (Fig. 3a). Hay menos células ciliadas del utrículo en P5 que en P23 (ref. 21), lo que también se reflejó en la señal iBAQ total (excluyendo contaminantes y coincidencias invertidas); había casi el doble de señal iBAQ en paquetes en P23 que en P5 (Fig. 3g).

El motor de búsqueda Andromeda incorporado de MaxQuant debe usarse para hacer coincidir los espectros de MS2 con los péptidos de la base de datos, y las proteínas se cuantificarán en función de su perfil de intensidad de MS1. Se debe usar la configuración predeterminada para el análisis MaxQuant de los archivos .RAW, con la excepción de que se debe marcar la opción de cuantificación iBAQ.

Escribimos un programa de Mathematica (versión 10.1.0.0) para procesar aún más el archivo de salida MaxQuant 'proteinGroups.txt'. Se proporcionan dos versiones del programa; 'MaxQuant 1.2.2.5 mouse 2013-12-19.nb' es la versión utilizada para analizar los datos en este proyecto, mientras que 'MaxQuant 1.4.1.2 2015-02-25.nb' se rediseñó para versiones más recientes de MaxQuant y es más robusto. Este programa realiza los siguientes pasos:

(1) Reemplazar nombres y símbolos de proteínas. Se utilizó un archivo de usuario con descripciones de proteínas y símbolos asociados con cada identificador ('Mouse abbrv table 2013-11-21.txt') para reemplazar la información proporcionada por el archivo FASTA. Para los símbolos de proteínas, usamos el nombre del gen, todo en mayúsculas y no en cursiva, en todos los casos. Las entradas ambiguas se resolvieron utilizando la función de búsqueda de ortólogos en Ensembl y con GeneCards (http://www.genecards.org).

(2) Eliminar entradas invertidas y contaminantes. Se eliminaron todas las entradas marcadas por MaxQuant como 'Posible contaminante' o 'Reverso'. Se conservaron las proteínas etiquetadas como 'Solo identificadas por sitio'.

(3) Agrupe las proteínas que comparten >20% de sus péptidos. Si un conjunto de péptidos para una proteína era idéntico o estaba completamente contenido dentro de otra proteína, MaxQuant agrupa esas proteínas juntas ("grupos redundantes"); la entrada con el mayor número de péptidos se utilizó para identificar el grupo redundante. Los grupos redundantes que compartían más del 20 % de sus péptidos identificados se agruparon adicionalmente en nuestro análisis ('grupos de péptidos compartidos'); la entrada con la mayor intensidad asociada con ella se usó para identificar el grupo de péptidos compartidos. Estos grupos se enumeran en el archivo con la etiqueta '_ 5_GROUPS _LIST.txt'.

(4) Preparar salida. Se generó un nuevo archivo ('proteinGroups 2013-12-18c_4_FINAL.txt') que contiene un conjunto de información más limitado.

La salida del archivo de Mathematica se importó a Excel. El archivo depositado en ProteomeXchange tiene todas las fórmulas utilizadas para el procesamiento aún intactas. Se llevaron a cabo los siguientes pasos:

(5) Calcular riBAQ. Para generar una abundancia relativa para cada proteína en su muestra, dividimos el valor de iBAQ de una proteína por la suma de todos los valores de iBAQ no contaminantes para esa muestra, obteniendo un iBAQ relativo (riBAQ). Hemos demostrado que, en promedio, riBAQ es una medida precisa de la abundancia de proteínas9.

(6) Calcular la media y la desviación estándar de las réplicas biológicas. Calculamos las desviaciones media y estándar sobre los valores de riBAQ, no sobre sus transformaciones logarítmicas.

(7) Calcule el enriquecimiento de BUN/UTR en cada edad de desarrollo. Estos valores de enriquecimiento permiten clasificar las proteínas que probablemente sean verdaderos componentes del paquete de aquellas que son contaminantes.

(8) Calcular el enriquecimiento P5/P23. Estas proporciones permiten la identificación de proteínas reguladas por el desarrollo.

Cómo citar este artículo: Krey, JF et al. El proteoma de haces de pelo vestibular de ratón durante el desarrollo. ciencia Datos 2:150047 doi: 10.1038/sdata.2015.47 (2015).

Kazmierczak, P. & Muller, U. Detección de sonido: moléculas que orquestan la mecanotransducción por parte de las células ciliadas. Tendencias Neurosci. 35, 220–229 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Shin, JB et al. Arquitectura molecular del haz de pelo vestibular del pollito. Nat Neurosci. 16, 365–374 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Avenarius, MR et al. Correlación de los niveles de expresión del reticulador y capper de actina con las fases de crecimiento de los estereocilios. Proteómica de células molares. 13, 606–620 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Dumont, RA, Zhao, YD, Holt, JR, Bahler, M. & Gillespie, PG Isoenzimas de miosina-I en epitelios auditivos y vestibulares de roedores neonatales. J. Asociado. Res. otorrinolaringol. 3, 375–389 (2002).

Artículo Google Académico

Ahlf, DR, Thomas, PM y Kelleher, NL Desarrollo de proteómica de arriba hacia abajo para maximizar el proteoma y la cobertura de secuencias de células y tejidos. actual Opinar química. Biol. 17, 787–794 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Gillet, LC et al. Extracción de datos dirigidos de los espectros MS/MS generados por adquisición independiente de datos: un nuevo concepto para el análisis de proteoma consistente y preciso. Proteómica de células molares. 11, O111.016717 (2012).

Artículo Google Académico

Lu, B., Xu, T., Park, SK & Yates, JR Identificación y cuantificación de proteínas de escopeta por espectrometría de masas. Métodos Mol. Biol. 564, 261–288 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Cox, J. & Mann, M. MaxQuant permite altas tasas de identificación de péptidos, precisiones de masa de rango de ppb individualizadas y cuantificación de proteínas de todo el proteoma. Nat. Biotecnología. 26, 1367-1372 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Krey, JF y col. Cuantificación precisa de proteínas sin etiquetas con espectrómetros de masas de alta y baja resolución. J. Proteoma. Res. 13, 1034–1044 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Gillespie, PG & Hudspeth, AJ Aislamiento de alta pureza de haces de pelo de rana toro y localización subcelular y topológica de proteínas constituyentes. J. Cell Biol. 112, 625–640 (1991).

Artículo CAS Google Académico

Cox, J. et al. Andromeda: un motor de búsqueda de péptidos integrado en el entorno MaxQuant. J. Proteoma. Res. 10, 1794–1805 (2011).

Artículo ADS CAS Google Académico

Taylor, CF et al. La información mínima sobre un experimento de proteómica (MIAPE). Nat. Biotecnología. 25, 887–893 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Shin, JB et al. Los paquetes de cabello están especializados para la entrega de ATP a través de la creatina quinasa. Neurona. 53, 371–386 (2007).

Artículo CAS Google Académico

Shin, JB, Pagana, J. & Gillespie, PG Purificación por torsión de mechones de cabello. Métodos Mol. Biol. 493, 241–255 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Holt, JR, Corey, DP & Eatock, RA Transducción y adaptación mecanoeléctrica en células ciliadas del utrículo de ratón, un órgano vestibular de baja frecuencia. J. Neurosci. 17, 8739–8748 (1997).

Artículo CAS Google Académico

Cunningham, LL El utrículo de ratón adulto como preparación in vitro para estudios de muerte de células ciliadas sensoriales inducida por fármacos ototóxicos. Res. cerebral. 1091, 277–281 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Spinelli, KJ et al. Distinto metabolismo energético de los epitelios sensoriales auditivos y vestibulares revelado por espectrometría de masas cuantitativa utilizando la intensidad de MS2. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 109, E268–E277 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Shin, JB et al. La variante R109H de fascin-2, un reticulante de actina regulado por el desarrollo en los estereocilios de las células ciliadas, es la base de la pérdida auditiva de aparición temprana en ratones DBA/2J. J. Neurosci. 30, 9683–9694 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Francisco, SP et al. Para el mantenimiento de la morfología de los estereocilios y la función auditiva se requiere una forma de empalme corto de la repetición de unión de Xin-actina que contiene 2 (XIRP2) que carece de las repeticiones de Xin. J. Neurosci. 35, 1999–2014 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Schwanhausser, B. et al. Cuantificación global del control de la expresión génica en mamíferos. Naturaleza 473, 337–342 (2011).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Burns, JC, On, D., Baker, W., Collado, MS & Corwin, JT Más de la mitad de las células ciliadas en el utrículo del ratón aparecen por primera vez después del nacimiento, y un número significativo se origina a partir de la producción mitótica posnatal temprana en las zonas de crecimiento periféricas y estriadas . J. Asociado. Res. otorrinolaringol. 13, 609–627 (2012).

Artículo Google Académico

Groves, AK & Fekete, DM Dando forma al sonido en el espacio: la regulación del patrón del oído interno. Desarrollo 139, 245–257 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Krey, J., Choi, D. y Barr-Gillespie, P. ProteomeXchange PXD002167 (2015)

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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones de NIH R01 DC002368, R01 DC011034 y P30 DC005983 a PGB-G., y F32 DC012455 a JFK. También se utilizó una subvención piloto de OCTRI (del premio CTSA UL1 TR000128) como apoyo.

Oregon Hearing Research Center & Vollum Institute, Oregon Health & Science University, Portland, 97239, OR, EE. UU.

Jocelyn F. Krey y Peter G. Barr-Gillespie

Laboratorio de espectrometría de masas biomédica WM Keck, Universidad de Virginia, Charlottesville, 22908, VA, EE. UU.

Nicholas E. Sherman y Erin D. Jeffery

Departamento de Salud Pública y Medicina Preventiva, Universidad de Ciencias y Salud de Oregon, Portland, 97239, OR, EE. UU.

Choi Dongseok

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JFK realizó todos los experimentos y editó el manuscrito. NES y EDJ llevaron a cabo espectrometría de masas. DC llevó a cabo el análisis estadístico. PGB-G. analizó los datos y escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron y aprobaron el manuscrito.

Correspondencia a Peter G. Barr-Gillespie.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Krey, J., Sherman, N., Jeffery, E. et al. El proteoma de haces de pelo vestibular de ratón durante el desarrollo. Datos científicos 2, 150047 (2015). https://doi.org/10.1038/sdata.2015.47

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Recibido: 27 mayo 2015

Aceptado: 13 de agosto de 2015

Publicado: 15 de septiembre de 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/sdata.2015.47

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