ROR2 se autorregula

Oct 31, 2023

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4449 (2022) Citar este artículo

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Los folículos pilosos se someten a ciclos de regeneración alimentados por células madre del folículo piloso (HFSC). Si bien la señalización Wnt canónica dependiente de β-catenina ha sido ampliamente estudiada e implicada en la activación y determinación del destino de HFSC, se sabe muy poco sobre la función de la señalización Wnt independiente de β-catenina en HFSC. En este estudio, investigamos el papel funcional de ROR2, un receptor Wnt, en HFSC. Al analizar los HFSC con reducción de Ror2, descubrimos que ROR2 no solo es esencial para regular la señalización activada por Wnt que es responsable de la activación y la autorrenovación de HFSC, sino que también es necesario para mantener una respuesta adecuada al daño del ADN dependiente de ATM/ATR, que es indispensable para el mantenimiento a largo plazo de los HFSC. Al analizar las HFSC que carecen de β-catenina, identificamos un papel compensatorio de la señalización de ROR2-PKC en la protección de las HFSC sin β-catenina de la pérdida del grupo de células madre. En conjunto, nuestro estudio revela un papel previamente no reconocido de ROR2 en la regulación de la autorrenovación y el mantenimiento de las células madre.

En los mamíferos, la señalización de Wnt funciona en la morfogénesis de tejidos, la activación de células madre y el desarrollo de tumores1,2. La unión de ligandos Wnt secretados a receptores y/o correceptores inicia diversas cascadas de señalización que se pueden dividir en vías de señalización Wnt canónicas dependientes de β-catenina y no canónicas independientes de β-catenina1. Estas vías podrían actuar de forma independiente o cooperativa para orquestar varias funciones celulares.

La señalización Wnt canónica (denominada señalización Wnt/β-catenina) se activa cuando un ligando Wnt se une a Frizzled (Fzd) y LRP-5/6, lo que desencadena la activación de las proteínas Disheveled (Dvl), lo que conduce a la inhibición del complejo de destrucción. , compuesto por Axina, caseína quinasa 1α (CK1α), poliposis coli adenomatosa (APC) y glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK3β), estabilizando así la β-catenina3,4. La proteína β-catenina estabilizada luego se transloca al núcleo donde se une a las proteínas del factor de aumento de linfoides/factor de células T (LEF/TCF) para activar la expresión del gen objetivo5. A diferencia de la señalización de Wnt/β-catenina, las vías de Wnt independientes de β-catenina involucran múltiples cascadas de señalización intracelular que podrían estar interconectadas. La inducción de señalización Wnt no canónica puede desencadenar la liberación de calcio intracelular, que a su vez activa las proteínas quinasas aguas abajo, como la proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina (CaMKII) y la proteína quinasa C (PKC)6,7,8. La señalización de Wnt no canónica también se puede transducir a través de la familia Rho de GTPasas pequeñas, que activan la quinasa N-terminal c-Jun (JNK) y el complejo de proteína activadora 1 aguas abajo (AP-1) para la regulación transcripcional, o modulan directamente el citoesqueleto. organización que orquesta la polaridad celular plana (PCP) y la migración celular9,10,11,12,13.

El receptor huérfano tipo tirosina quinasa 2 (ROR2) se identificó inicialmente junto con ROR1 como una tirosina quinasa de la familia Trk14, y luego se reconoció como uno de los (co-)receptores Wnt debido a su capacidad para interactuar con Wnts no canónicos. incluidos Wnt4, Wnt5a y Wnt1115,16. Los estudios genéticos muestran que los ratones Ror2-/- mostraron sorprendentes similitudes con los ratones Wnt5a-/-, lo que sugiere que pueden funcionar en la misma vía de señalización10,17. En los vertebrados, se requiere ROR2 para la migración celular inducida por Wnt5a, una función que implica la activación de JNK, PKC, la proteína de unión a actina Filamina A y la familia Rho de la GTPasa17,18,19,20,21. La interacción de Wnt-ROR2 conduce a la fosforilación de Dvl que induce la activación de AP-1 y Rac122,23. Además, se demostró que ROR2 interactúa y es fosforilado por CK1 y GSK3, ambas quinasas que también desempeñan un papel fundamental en la señalización de Wnt/β-catenina20,24,25,26. En múltiples sistemas, se demostró que Wnt5a inhibe la señalización canónica de Wnt mediada por β-catenina27,28,29. La naturaleza por la cual ROR2 media el antagonismo dependiente de Wnt5a de la señalización de Wnt/β-catenina sigue siendo controvertida. En determinadas circunstancias, Wnt5a inhibe la señalización de β-catenina inducida por Wnt3a a través de ROR222,30,31,32,33; en otros, no se requiere ROR2 para esta inhibición10,26,34. Por el contrario, también se ha informado que ROR2 potencia la señalización de Wnt/β-catenina. En las células de osteosarcoma, ROR2 mejora la respuesta transcripcional a Wnt135; en las células de carcinoma de pulmón, ROR2 activa la señalización Wnt canónica inducida por Wnt3a como co-receptor con Fzd231. La sobreexpresión de ROR2 mejora la transcripción mediada por β-catenina; por el contrario, la eliminación de ROR2 lo disminuye en las células de cáncer renal36. Cabe señalar que los estudios que analizaron el efecto de ROR2 en la señalización de Wnt/β-catenina han dependido principalmente de la sobreexpresión de proteínas y el ensayo informador para la actividad de señalización de Wnt/β-catenina. El efecto fisiológico de ROR2 en las actividades de señalización de Wnt requiere más investigación.

Todas las células del cuerpo están expuestas al daño del ADN causado por factores exógenos, incluidos los mutágenos, o procesos endógenos, como el estrés oxidativo. Por lo tanto, para mantener la integridad genómica que asegure la homeostasis de los tejidos y prevenga el desarrollo de enfermedades nocivas como el cáncer, la reparación del ADN mediada por la respuesta al daño del ADN (DDR) es de vital importancia, particularmente para las células madre adultas (CS), ya que persisten durante periodos prolongados en tejidos adultos37,38. La ataxia telangiectasia mutada (ATM) y la relacionada con ATM y Rad3 (ATR) son quinasas DDR que se activan principalmente por daño genómico; sin embargo, las funciones de ATM y ATR en las especificidades del daño del ADN son distintas39,40. En respuesta al daño del ADN, ATM y ATR se activan y fosforilan las proteínas de señalización posteriores, como el punto de control quinasa 2 (CHK2) para ATM y el punto de control quinasa 1 (CHK1) para ATR, regulando así los puntos de control del ciclo celular, la reparación del ADN o la apoptosis39,40 ,41. Independientemente de la DDR, tanto ATM como ATR también pueden activarse por la producción excesiva de especies reactivas de oxígeno (ROS), que podría ser causada por un metabolismo oxidativo desequilibrado y/o acumulación de daño en el ADN no reparado42,43,44,45. En respuesta a ROS, ATM induce la activación de la proteína quinasa activada por AMP 5' (AMPK)43,46 y el factor 2 relacionado con el factor nuclear eritroide 2 (NRF2)47,48 para modular el metabolismo oxidativo e inducir la respuesta antioxidante para combatir las ROS, respectivamente . La deficiencia de DDR dependiente de ATM en SC puede conducir a una autorrenovación deficiente o apoptosis que podría influir en la cantidad de células madre y su funcionalidad49,50,51.

El folículo piloso (HF) es un sistema modelo excelente para estudiar los mecanismos subyacentes que regulan la activación y el mantenimiento de las células madre52. Los HF maduros progresan a través de ciclos de crecimiento (anágeno), degeneración (catágeno) y luego reposo (telógeno)53,54. Las células madre del folículo piloso (HFSC), ubicadas en la protuberancia del HF en reposo, permanecen inactivas durante la fase telógena del ciclo del cabello. Al inicio de la anágena, algunos de los HFSC se vuelven proliferativos y migran hacia abajo para reponer el HF55 inferior. La activación de las HFSC está estrictamente regulada por señales microambientales provenientes de sus células de nicho56,57,58,59,60,61. Al inicio de la anágena, la señalización de Wnt/β-catenina regulada al alza dirige la regulación transcripcional que gobierna la activación de HFSC62,63,64. Las HFSC que carecen de β-catenina no pueden someterse a la regeneración del cabello62,63,65, pero pueden mantenerse en su nicho nativo sin perder la identidad de HFSC63. Sin embargo, no está claro cuál es el mecanismo que mantiene el grupo de HFSC sin β-catenina en un entorno rico donde las células vecinas secretan varias moléculas de señal a lo largo del ciclo del cabello.

En este estudio, identificamos un papel sorprendente para ROR2 en la regulación de la autorrenovación y el mantenimiento de las células madre. Usando un modelo de ratón genético, mostramos que el agotamiento de Ror2 en HFSC causó un retraso en la activación de HFSC, la regulación a la baja de los genes de tallo de HFSC y, finalmente, condujo a la pérdida de una población de HFSC. Al agotar Ror2 en HFSC de cultivo primario, descubrimos que ROR2 es esencial para la activación de la señalización inducida por Wnt y DDR dependiente de ATM/ATR, regulando así la migración, proliferación y mantenimiento de HFSC. Por último, al analizar las HFSC que carecen de β-catenina, identificamos la necesidad de ROR2 y la PKC aguas abajo para proteger las HFSC sin β-catenina de la pérdida del grupo de células madre y la diferenciación de destino incorrecta. Juntos, nuestros resultados revelan que ROR2 no solo regula la señalización de Wnt que rige la activación y migración de HFSC, sino que también sirve como un mecanismo de protección para garantizar el mantenimiento a largo plazo de HFSC.

Si bien las HFSC residen en un nicho que expresa ligandos Wnt a lo largo del ciclo del cabello66, se sabe muy poco sobre la función de la señalización de Wnt en las HFSC aparte de la regulación dependiente de β-catenina. Para abordar esta cuestión no resuelta, nos centramos en un receptor Wnt, ROR2, que es capaz de transducir señales Wnt dependientes e independientes de β-catenina17,18,19,20,21,31,35. Primero examinamos la expresión de ROR2 en HF usando inmunotinción de piel de montaje completo. Como se muestra, ROR2 se expresa bastante bien en HFSC y células vecinas en la protuberancia (Bu), pero relativamente bajo en el germen de cabello secundario (HG) (Fig. 1a y Fig. 1a complementaria). En particular, la expresión de ROR2 en la protuberancia es mayor en los HF al inicio de la anágena que en la telógena (Fig. 1b complementaria). Mediante la purificación de HFSC de integrina α6high/CD34+ de HF de ratón en el inicio telógeno (denominado HFSC inactivo; qHFSC) y anágeno (denominado HFSC activado; aHFSC) mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), confirmamos que el nivel de proteína ROR2 se elevó en aHFSC en comparación con qHFSC (Fig. 1b y Fig. 1c complementaria). Para determinar si el ROR2 regulado al alza es funcionalmente significativo para la activación de HFSC, generamos ratones K15CrePGR;Ror2fl/fl;ROSA26LSL−YFP cruzando la línea de ratón que lleva la recombinasa Cre inducible impulsada por el promotor K15 (K15CrePGR) con los ratones que llevan alelos Ror2 condicionales (Ror2fl/ fl) y un reportero YFP activado por Cre (ROSA26LSL−YFP), y luego se agotó el gen Ror2 en HFSC y sus progenies en los días 18–25 postnatales (P) (Fig. 1c). Observamos que la expresión de ROR2 se vio comprometida en los HFSC con eliminación condicional (Ror2 cKO) de Ror2 purificados por FACS (Fig. 1d y Fig. 1d complementaria), así como también disminuyó en la protuberancia de Ror2 cKO HF, mientras que ROR1 permaneció bastante expresado (Fig. 1e). Al analizar la progresión del ciclo del cabello, encontramos que Ror2 cKO HF mostró un retraso en la entrada de anagen en comparación con el control (Ror2 Ctrl) HF (Fig. 1e). El retraso en la entrada de anágena se detectó continuamente en el siguiente ciclo de pelo al inicio de la anágena, como lo demuestra la entrada retrasada de anágena del Ror2 cKO HF y la recuperación del pelaje del animal Ror2 cKO (Fig. 1f complementaria). Para abordar si el retraso de la entrada de anagen en Ror2 cKO HF fue causado por un defecto en la activación de HFSC, realizamos la administración de EdU durante 24 horas a ratones al inicio de anagen. La inmunotinción de la piel Ror2 Ctrl y cKO para CD34 y EdU mostró una disminución significativa en las HFSC proliferativas de EdU + en la protuberancia YFP + de Ror2 cKO HF (Fig. 1f), lo que sugiere que las HFSC Ror2 cKO mostraron una proliferación celular reducida.

a Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de HF de ratón en el inicio anágeno y telógeno para ROR2 (rojo) y CD34 (verde). Bu, bulto; HG, germen de pelo. b La expresión de ROR2 está regulada al alza en HFSC activados. Análisis de inmunotransferencia de HFSC purificados con FACS de P55 (para HFSC inactivo; qHFSC) y P22-23 (para HFSC activado; aHFSC) pieles de espalda de ratón para ROR2 y β-actina. La cuantificación de los niveles de proteína ROR2 de experimentos independientes se muestra en el siguiente gráfico. Los datos se normalizaron a β-actina. Los valores se calcularon comparándolos con qHFSC y se informaron como promedio ± sd; n = 4 transferencias de HFSC clasificados por FACS independientes; *p = 0,0117. c Diagrama esquemático que ilustra la entrada retrasada del ciclo del cabello en ratones Ror2 cKO en comparación con sus compañeros de camada Ctrl. Los ratones se trataron con RU486 para activar la recombinasa Cre en HFSC en P18-25. Morfogénesis M, Tel telógena, Ana anágena, Catágena Cat, M machos, F hembras. d Análisis de PCR en tiempo real con Ror2 Ctrl y cKO HFSC purificados por FACS desde el inicio anágeno (Ana) y telógeno tardío (Tel tardío). Los valores se normalizaron a ARNm de Ror2 Ctrl HFSC. Los datos se reportan como promedio ± sd; n = 5 (Ana) o 4 (Late Tel) animales biológicamente independientes; ** p < 0,005. e Tinción H & E de Ror2 Ctrl y pieles de lomo de ratón cKO en los días posnatales (P) indicados (arriba). Cuantificación del porcentaje de HF en las etapas indicadas del ciclo capilar que muestra un retraso en la entrada anágena de Ror2 cKO HF (abajo). f Ror2 cKO HFSC muestran un retraso en la activación al inicio de la anágena. Después de 24 h de etiquetado EdU, las pieles femeninas P32 se inmunoteñeron (izquierda) y cuantificaron (derecha). Mx, matriz. Los datos se informan como la mediana (la línea dentro del cuadro), los percentiles 25 a 75 (líneas inferior y superior del cuadro) y los percentiles 10 a 90 (bigotes inferior y superior); n = 7 (Ctrl) o 4 (cKO) HF examinados en una pareja de animales; ** p = 0,0031. Todos los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de dos lados no apareados. Las barras de escala en a, e, f representan 50 μm. Todos los resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para verificar aún más el papel de ROR2 en la activación de HFSC, también analizamos el efecto del agotamiento de Ror2 en HFSC que se sincronizaron y activaron mediante la depilación del cabello en la segunda fase telógena (Figura complementaria 2a). El análisis histológico y los experimentos de etiquetado de EdU con piel depilada Ror2 Ctrl y cKO mostraron un retraso en la activación de HFSC inducida por la depilación y la entrada de anágenos en la piel Ror2 cKO (Fig. 2a y Fig. 2b complementaria), lo que está de acuerdo con lo que encontramos en el cabello. ciclismo durante la homeostasis (Fig. 1e, f). El defecto de proliferación de HFSC podría recapitularse en HFSC purificadas con FACS de Ror2 Ctrl y cKO HF al inicio de la anágena. Específicamente, cuando las HFSC primarias se cultivaron con células alimentadoras de fibroblastos en el medio que promueve la proliferación de HFSC, las HFSC Ror2 cKO exhibieron un menor número de colonias que las HFSC Ctrl (Fig. 2b), lo que indica una capacidad disminuida de las HFSC Ror2 cKO para proliferar. Dado que la señalización de Wnt/β-catenina es esencial para la activación de HFSC y que ROR2 sobreexpresado es capaz de transducir la señalización canónica de Wnt en las células cultivadas31,35, la activación retardada de Ror2 cKO HFSC podría deberse en parte al deterioro en β-catenina- actividad de señalización Wnt dependiente. Para abordar esta posibilidad, examinamos la expresión de los genes diana de Wnt/β-catenina63 en Ror2 Ctrl y cKO HFSC purificados con FACS de piel 3 días después de la depilación (3dpd) mediante la realización de un análisis de PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR). Como se muestra en la Fig. 2c, la expresión de genes que responden a la señalización de Wnt dependiente de β-catenina se reguló significativamente en las HFSC Ror2 cKO activadas por depilación. Esta regulación a la baja también se detectó en Ror2 cKO HFSC al inicio de la anágena durante el ciclo del cabello (Fig. 2d). Estos resultados sugieren que la activación de la señalización de Wnt/β-catenina que facilita la proliferación de HFSC y la progresión anágena depende de ROR2, y la reducción de la actividad de señalización de Wnt canónica tras el agotamiento de Ror2 conduce al retraso de la activación de HFSC.

a Los HFSC Ror2 cKO activados por depilación muestran un retraso en la activación. Dos días después de la depilación y 24 h después del marcaje con EdU, las pieles depiladas se inmunoteñeron (izquierda) y cuantificaron (derecha). Los datos se informan como la mediana (la línea dentro del cuadro), los percentiles 25 a 75 (líneas inferior y superior del cuadro) y los percentiles 10 a 90 (bigotes inferior y superior); n = 8 (Ctrl) o 10 (cKO) HF examinados en una pareja de animales; *** p < 0,0001. La barra de escala representa 50 μm. b Eficiencia de formación de colonias (CFE) de Ror2 Ctrl y cKO HFSC de pieles posteriores con inicio anágeno. Las colonias de HFSC purificadas con FACS se tiñen con rodamina B (izquierda). Cuantificación de CFE (derecha). Se contó el número de colonias cuyos tamaños ≥ 3 mm2. Los datos se reportan como promedio ± sd; n = 3 pozos independientes; *p = 0,0269. Los resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes. c, d Análisis de PCR en tiempo real para genes diana de Wnt/β-catenina con Ror2 Ctrl y cKO HFSC purificados con FACS 3 días después de la depilación (c) o al inicio de la anágena (d). Los valores se normalizaron a ARNm de Ror2 Ctrl HFSC. e, f Análisis de PCR en tiempo real para genes de tallo HFSC con Ror2 Ctrl y cKO HFSC purificados por FACS 3 días después de la depilación (e) o en el telógeno tardío (f). Los datos en c–f se reportan como promedio ± sd; n = 4 animales biológicamente independientes; *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. g Análisis FACS para células YFP+ en la población de HFSC con integrina α6high/CD34+ de Ror2 Ctrl y cKO HF antes de la depilación (izquierda) y 3 semanas después de la depilación (centro). El gráfico de puntos (derecha) muestra los porcentajes de YFP+ HFSC recuperadas 3 semanas después de la depilación. Los datos se informan como media ± SEM; n = 4 animales biológicamente independientes; *p = 0,0365. h Análisis FACS para células YFP+ en la población de HFSC con integrina α6high/CD34+ de Ror2 Ctrl y cKO HFs en el segundo telógeno. El gráfico de puntos emparejados muestra porcentajes reducidos de YFP+ HFSC en Ror2 cKO HF frente a Ror2 Ctrl HF. n = 10 parejas independientes de hermanos de camada; ***p = 0,0003. Todos los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de dos lados no apareados. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además de los genes diana de Wnt / β-catenina, también encontramos que los HFSC Ror2 cKO activados por depilación mostraron una regulación negativa significativa de un amplio conjunto de genes de tallo HFSC en comparación con sus Ctrl HFSC (Fig. 2e). La regulación a la baja de estos genes también se encontró en Ror2 cKO HFSC al final del segundo telógeno cuando las HFSC se prepararon para la activación (Fig. 2f). Estos resultados nos llevaron a postular que ROR2 también puede ser necesario para el mantenimiento de la piscina HFSC durante la regeneración HF. Para probar esta hipótesis, depilamos la capa de pelo de los ratones y luego usamos FACS para medir el porcentaje de células YFP+ en la población de HFSC con integrina α6high/CD34+ antes de la depilación y 3 semanas después de la depilación cuando las HF recién formadas volvieron a ser telógenas. Como se muestra en la Fig. 2g, las HFSC YFP+ Ror2 Ctrl se mantuvieron por completo en el nicho de células madre después de que se completó la regeneración de HF, pero solo ~82 % de las HFSC YFP+ se recuperaron del grupo anterior de HFSC Ror2 cKO, lo que sugiere que algunas HFSC Ror2 cKO se recuperaron. perdido durante la regeneración HF. Se detectó un fenómeno similar en Ror2 cKO HFSC durante el ciclo del cabello. Al examinar el porcentaje de células YFP+ en la población de HFSC α6high/CD34+ de Ror2 Ctrl y cKO HF en la segunda fase telógena, descubrimos que Ror2 cKO HF mostró un porcentaje más bajo de células YFP+ en sus grupos de HFSC que los Ror2 Ctrl HF emparejados (Fig. 2h), lo que indica que algunos Ror2 cKO HFSC no se recuperaron después del ciclo del cabello. Sin embargo, notamos que si algún Ror2 cKO HFSC podía sobrevivir a través de la primera depilación, podía mantener la regeneración HF posterior tras la depilación repetitiva (Fig. 3a complementaria). Esto podría explicar por qué los HFSC YFP + Ror2 cKO podrían mantenerse de manera justa en algunos HF envejecidos (Fig. 3b complementaria). Este resultado sugiere que la pérdida de ROR2 podría compensarse con otros factores en las HFSC Ror2 cKO recuperadas.

En conjunto, nuestros resultados implican que se requiere ROR2 para la activación de HFSC a través de la regulación de la actividad de señalización de Wnt/β-catenina, y también para el mantenimiento de una población de HFSC in vivo.

Como descubrimos que el grupo de HFSC se redujo en Ror2 cKO HF durante la regeneración de HF, evaluamos la capacidad de mantenimiento de HFSC realizando ensayos de formación de colonias y seguido por el cultivo a largo plazo con HFSC purificado con FACS de Ror2 Ctrl y cKO HF en telógeno. Encontramos que las HFSC telogen Ror2 cKO también mostraron un número reducido de colonias en el medio de cultivo que promueve la proliferación (Fig. 3a), lo que indica un defecto en la capacidad de autorrenovación. Cuando se seleccionaron colonias individuales de HFSC que crecieron en una capa de alimentación y se pasaron en serie en cultivo, las HFSC Ror2 cKO no se pudieron mantener a largo plazo (Fig. 3b). Además, tras la eliminación de las células alimentadoras, las HFSC Ror2 cKO perdieron la capacidad de proliferar y mostraron una morfología diferenciada (Fig. 3c). Estos Ror2 cKO HFSC similares a la diferenciación no solo expresaron una ciclina D1 más baja (codificada por Ccnd1), correspondiente a su menor proliferación, sino que también perdieron la expresión de los marcadores HFSC, Cd34 y Krt15 (Fig. 3d), lo que implica que ROR2 es esencial para mantener identidad HFSC. En conjunto, los resultados de las HFSC purificadas en cultivo confirman nuestros estudios in vivo que demuestran que ROR2 desempeña un papel fundamental en la autorrenovación y el mantenimiento de HFSC.

un CFE de Ror2 Ctrl y cKO HFSC de pieles posteriores en fase telógena. Las colonias de HFSC purificadas con FACS se tiñen con rodamina B (izquierda). Cuantificación de CFE (derecha). Se contó el número de colonias cuyos tamaños ≥ 3 mm2. Los datos se reportan como promedio ± sd; n = 3 pozos independientes; ** p = 0,0007. Los resultados son representativos de al menos dos experimentos independientes. b Ror2 cKO HFSC no se pudo pasar y mantener a largo plazo. Se aislaron, cultivaron y pasaron colonias individuales de Ror2 Ctrl o cKO HFSC. Se verificó el agotamiento de Ror2 para colonias individuales. (Izquierda) Ror2 Ctrl HFSC se pudo pasar y mantener con alimentadores como lo demuestra la expresión de YFP, mientras que YFP+ Ror2 cKO HFSC se perdió durante el pase. Las líneas discontinuas blancas indican el contorno de las colonias de HFSC. La barra de escala representa 200 μm. (Derecha) Gráfico de trazado que muestra que las HFSC Ror2 cKO no se pueden mantener a largo plazo en cultivo. Los datos se reportan como promedio ± sd; n = 3 grupos, se examinaron 6 colonias por grupo. c Las HFSC Ror2 cKO cultivadas muestran una morfología similar a la diferenciación y una capacidad de proliferación reducida. (Izquierda) Imágenes de contraste de interferencia diferencial (DIC) de HFSC Ror2 Ctrl y cKO cultivadas a largo plazo. (Derecha) Las capacidades de proliferación de Ror2 Ctrl y cKO HFSC se midieron en función de los recuentos diarios del número de células. Los datos se reportan como promedio ± sd; n = 3 pocillos de muestras individuales. La barra de escala representa 50 μm. d Las HFSC cKO Ror2 cultivadas muestran una expresión reducida de los marcadores HFSC, Cd34 y Krt15. qPCR de ARNm (izquierda) e inmunotransferencia (derecha) de Ror2 Ctrl y cKO HFSC de paso superior. Los datos se reportan como promedio ± sd; n = 3 colonias HFSC independientes; Ror2, **p < 0,0001; Ccnd1, **p = 0,0001; Cd34, **p = 0,0075; Krt15, **p = 0,0028. Todos los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de dos lados no apareados. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Como las HFSC Ror2 cKO purificadas no se pudieron mantener en cultivo, generamos Ror2-/- HFSC cultivando HFSC que portan alelos Ror2 condicionales (Ror2fl/fl) y el reportero YFP (ROSA26LSL-YFP), y transduciéndolas con recombinasa Cre lentiviral en cultivo ( Figura complementaria 4a). De esta manera, pudimos examinar las alteraciones de la transducción de señales y la expresión génica en HFSC tras la pérdida de Ror2. Primero confirmamos la eficiencia del agotamiento de Ror2 en HFSC. Como se muestra, la expresión de la proteína ROR2 se eliminó por completo en las HFSC que expresan Cre (Ror2-/-), mientras que la expresión de ROR1 se elevó en las HFSC Ror2-/- durante el paso (panel izquierdo, Fig. 4a). Luego caracterizamos las HFSC Ror2-/- examinando sus respuestas a la estimulación Wnt. Estudios previos han demostrado que ROR2 media la migración celular inducida por Wnt5a a través de la activación de JNK, PKC y pequeñas GTPasas17,18,19,20,21. Aquí examinamos el control (Ror2+/+) y Ror2-/- HFSC para la activación de JNK y PKC inducida por Wnt5a, así como para las actividades de Rac1 y Cdc42. Al realizar un análisis de transferencia Western con HFSC estimuladas con Wnt, mostramos que Dvl2 estaba fosforilado (bandas superiores desplazadas, punta de flecha en el panel izquierdo de la Fig. 4a) y las proteínas efectoras JNK y PKC aguas abajo de las subfamilias clásicas y novedosas (denominadas PKC en nuestro estudio) se activaron con la estimulación de Wnt5a en Ror2+/+ HFSC, pero estas actividades se atenuaron en Ror2-/- HFSC (+Wnt5a, panel izquierdo, Fig. 4a). Usando un pequeño ensayo de activación de GTPasa establecido que emplea proteínas de fusión de glutatión S-transferasa (GST) que reconocen formas activas (formas unidas a GTP) de Rac1 y Cdc42, encontramos que, independientemente de la estimulación de Wnt5a, las actividades de Rac1 y Cdc42 se redujeron de manera prominente en Ror2 −/− HFSC (Fig. 4b). Es de destacar que, aunque ROR1 se reguló al alza en cultivos de HFSC Ror2-/-, esta regulación al alza aparentemente fue insuficiente para compensar la regulación de señalización mediada por Wnt5a-ROR2. Juntos, estos datos demuestran el papel esencial de ROR2 en la transducción de señalización dependiente de Wnt5a en HFSC.

a Las HFSC Ror2+/+ y Ror2-/- se trataron con Wnt5a o Wnt3a durante 30 y 60 minutos antes de recolectarlas para la inmunotransferencia. La punta de flecha indica la forma fosforilada de la proteína Dvl2. Los valores de cambio en los niveles de proteína se muestran debajo de las bandas indicadas. Los datos se normalizaron a β-actina o α-tubulina y se calcularon comparándolos con Ror2+/+ HFSC a 0'. A continuación se muestra la cuantificación de proteínas fosforiladas a proteínas totales en el transcurso del tiempo. b Las HFSC Ror2+/+ y Ror2-/- se trataron con Wnt5a durante 2 h, y Rac1 o Cdc42 unidos a GTP se extrajeron e identificaron mediante un pequeño ensayo de activación de GTPasa. Se muestra la cuantificación de los niveles de proteína. Los datos de proteínas totales se normalizaron a β-actina. Se requiere c ROR2 para la activación transcripcional de la señalización Wnt canónica. Los HFSC se privaron de alimento durante la noche y luego se trataron con Wnt3a durante 6 h. Los pliegues de la inducción de Wnt3a se calcularon comparando las HFSC tratadas con Wnt3a con sus contrapartes tratadas con vehículo. Los pliegues de reducción se muestran encima de las barras. Los datos se informan como promedio ± sd d La inhibición de la actividad de GSK3β restaura la expresión de genes diana Wnt canónicos en Ror2-/- HFSC. Análisis de PCR en tiempo real de Ror2+/+ y Ror2-/- HFSC tratados con DMSO (vehículo) o CHIR-99021 (GSK3i) durante 24 h. Las HFSC Ror2-/- no responden a la migración celular inducida por Wnt5a. Las capacidades de migración de Ror2+/+ y Ror2-/- HFSC se examinaron mediante un ensayo de migración de células Transwell con Wnt5a o suero como quimioatrayente. f Análisis de PCR en tiempo real de Ror2+/+ y Ror2-/- HFSC para Ror2, Ror1, HFSC stemness y genes relacionados con el destino de HF. Tenga en cuenta que, a excepción de Nfatc1, que está relacionado con el estado de reposo de las HFSC, las HFSC Ror2-/- expresaron niveles más bajos de troncalidad de HFSC y genes relacionados con el destino de HF. Los datos en d-f se reportan como promedio ± sd; n = 3 experimentos independientes; *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Todos los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de dos lados no apareados. Todos los resultados de inmunotransferencia son representativos de al menos dos experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

No solo Wnt5a, sino Wnt3a, un ligando canónico de Wnt, también podría activar JNK en HFSC de manera independiente de ROR2 (+Wnt3a, panel izquierdo, Fig. 4a). Curiosamente, el agotamiento de Ror2 podría comprometer de manera prominente la inactivación de GSK3β inducida por Wnt3a y la degradación de Axin1 (+Wnt3a, panel derecho, Fig. 4a). Como se muestra, la estimulación de Wnt3a y Wnt5a podría inducir la inactivación de GSK3β, monitoreada por el aumento en la fosforilación de Ser-9; sin embargo, esta inactivación se eliminó en Ror2-/- HFSC (panel derecho, Fig. 4a). Sorprendentemente, la forma inactiva general de GSK3β fue más baja que la de los HFSC de control (panel derecho, Fig. 4a), mientras que la fosforilación de GSK3β en Tyr-216 no se alteró (Fig. 4b complementaria). Dado que GSK3β se considera una quinasa constitutivamente activa67,68, la reducción en el nivel de su forma inactiva sugiere la elevación de la actividad de la quinasa GSK3β. De hecho, la actividad elevada de GSK3β en Ror2-/- HFSC se confirmó mediante un aumento en p-β-catenina S33/37/T41 (panel derecho, Fig. 4a). Un aumento en p-LRP6S1490 es la otra evidencia de actividad elevada de GSK3β en Ror2-/- HFSC (panel derecho, Fig. 4a). En línea con esta observación, también descubrimos que las HFSC Ror2-/- mostraron una reducción significativa en la expresión inducida por Wnt3a de genes diana Wnt canónicos en comparación con las HFSC Ror2+/+ (Fig. 4c). La inhibición de la actividad de GSK3β mediante el tratamiento de CHIR-99021 (inhibidor de GSK3; GSK3i) aumentó el conjunto total de β-catenina (Fig. 4c complementaria) y restauró la expresión de genes diana Wnt canónicos en Ror2-/- HFSC (Fig. 4d ), destacando además que la regulación a la baja de la señalización de Wnt/β-catenina en Ror2-/- HFSC fue causada por la actividad GSK3β desatada que mejoró la degradación de β-catenina. Estos resultados respaldan nuestro hallazgo in vivo que muestra que los genes objetivo de Wnt / β-catenina se regularon a la baja en Ror2 cKO HFSC activados (Fig. 2c, d), y sugieren que la regulación a la baja de la señalización de Wnt / β-catenina podría ser uno, pero no el único , causa de la activación retardada de HFSC.

La reducción en las actividades de JNK, PKC y GTPasas pequeñas sugirió que las HFSC Ror2-/- podrían tener defectos en la migración celular inducida por Wnt5a. Para explorar esta posibilidad, realizamos un ensayo de migración de células transwell con HFSC Ror2+/+ y Ror2-/- utilizando Wnt5a o suero como quimioatrayente. Como se muestra en la Fig. 4e, Wnt5a promovió significativamente la migración celular de las HFSC Ror2+/+, pero este efecto migratorio se eliminó por completo en las HFSC Ror2-/-. Incluso después de la estimulación con suero, que contiene estímulos de migración adicionales, las HFSC Ror2-/- aún no podían migrar de manera eficiente (Fig. 4e), lo que sugiere que las HFSC Ror2-/- son defectuosas en el movimiento celular. De hecho, cuando se examinaron mediante un ensayo de migración de heridas por rasguños, las HFSC Ror2-/- mostraron una capacidad reducida en la migración celular colectiva (Fig. 4d complementaria), lo que indica el papel insustituible de ROR2 en la regulación de la motilidad de HFSC.

Además, de acuerdo con nuestros hallazgos in vivo (Fig. 2e, f), también descubrimos que las HFSC Ror2-/- cultivadas no pudieron mantener la expresión de los genes de tallo HFSC. De hecho, a excepción de Nfatc1, que está asociado con la inactividad de HFSC, las HFSC Ror2-/- expresaron niveles más bajos de genes de tallo HFSC, así como genes relacionados con el destino de HF (Fig. 4f). En conjunto, nuestros análisis con HFSC cultivadas que carecen de Ror2 no solo confirman los descubrimientos previos de que ROR2 media la señalización dependiente de Wnt5 y la migración celular a través de la activación de JNK, PKC y pequeñas GTPasas, sino que también demuestran que se requiere ROR2 endógeno para mantener Wnt-canónico. indujo la activación transcripcional de β-catenina a través de la regulación de la estabilidad de GSK3β.

Además de los defectos de migración celular, al realizar experimentos de etiquetado de EdU, también observamos que menos Ror2-/- HFSC se sometieron a la síntesis de ADN en fase S, como lo demuestra un número reducido de Ror2-/- HFSC que muestran la incorporación de EdU (Fig. 5a). Curiosamente, el análisis del ciclo celular por citometría de flujo mostró una disminución en la porción de Ror2-/- HFSC en la fase G0/G1 y la acumulación de Ror2-/- HFSC en las fases S y G2/M (Fig. 5b). Los resultados del etiquetado de EdU y el análisis del ciclo celular señalaron que las HFSC Ror2-/- mostraron una progresión de la fase S más lenta y una detención del ciclo celular G2/M. La ralentización de la replicación del ADN es el sello distintivo del punto de control del daño del ADN en la fase S, y la detención del ciclo celular G2/M también es una consecuencia del daño del ADN69,70; por lo tanto, nuestros resultados sugirieron que las HFSC Ror2-/- estaban montando una respuesta al daño del ADN. El daño del ADN puede desencadenarse por factores exógenos o fuentes endógenas. Dada la igualdad de condiciones de cultivo de las HFSC Ror2+/+ y Ror2-/-, es probable que los procesos endógenos, como el estrés oxidativo, sean la fuente que causa el daño del ADN en las HFSC Ror2-/-. Para abordar estas posibilidades, realizamos inmunotinción para γH2AX, un biomarcador para roturas de doble cadena de ADN (DSB)71, y 8-oxoguanina (8-oxoG), un biomarcador para medir el efecto del daño oxidativo del ADN72. Como se muestra en la Fig. 5c y la Fig. 5a complementaria, tres veces más Ror2-/- HFSC que muestran más de 6 focos γH2AX que Ror2+/+ HFSC indicaron la acumulación de DSB de ADN en Ror2-/- HFSC. También encontramos un porcentaje significativo de Ror2-/- HFSC que mostraban tinción nuclear de 8-oxoG, algo que no se detectó en los núcleos de Ror2+/+ HFSC (Fig. 5d). La tinción nuclear de 8-oxoG en Ror2-/- HFSC sugirió un aumento en la producción de ROS intracelular. A juzgar por la tinción con el colorante CellROX, el nivel de ROS fue significativamente mayor en las HFSC Ror2-/- (Fig. 5e). Nuestros resultados en conjunto implican que el agotamiento de Ror2 da como resultado un exceso de producción de ROS y acumulación de daño en el ADN, lo que a su vez conduce a una proliferación lenta y una detención del ciclo celular.

Las HFSC Ror2-/- muestran una proliferación celular reducida. Los HFSC se marcaron con EdU durante 4 h antes del examen. Los datos se informan como media ± SEM; n = 5 experimentos independientes; *** p = 0,00001. b El agotamiento de Ror2 provoca una progresión más lenta de la fase S y la detención del ciclo celular en la fase G2/M. (Izquierda) El contenido de ADN de las HFSC se tiñó con DAPI y se analizó mediante citometría de flujo. (Derecha) El gráfico de barras muestra la distribución del ciclo celular. c Ror2-/- HFSC muestran un aumento significativo en las roturas de doble cadena. Tinción de inmunofluorescencia de Ror2+/+ y Ror2-/- HFSC para γH2AX (rojo). Las puntas de flecha indican focos γH2AX. A la derecha se muestra la cuantificación de las células que muestran más de 6 focos. d Tinción de inmunofluorescencia de HFSC Ror2+/+ y Ror2-/- para queratina 5 (Krt5; verde) y 8-oxoguanina (8-oxoG; rojo). La cuantificación de células que muestran 8-oxoG nuclear se muestra a la derecha. e Análisis de citometría de flujo del nivel de ROS en HFSC Ror2+/+ y Ror2−/− utilizando el reactivo CellROX Deep Red. Los valores de cambio de pliegue en el nivel de ROS se muestran a la derecha. f–i Análisis de inmunotransferencia de Ror2+/+ y Ror2-/- HFSC para proteínas activadas y totales de ATM y ATR (f), AMPK (h), NRF2 (i), así como para sustratos de ATM/ATR fosforilados y ROR2 ( gramo). Se usaron vinculina, α-tubulina y β-actina como controles internos para los experimentos indicados. Los valores de cambio en los niveles de proteína se muestran debajo de las bandas indicadas. j La inhibición de la actividad de GSK3β restaura el nivel de expresión y la actividad de NRF2, pero no de AMPK, en Ror2-/- HFSC. Análisis de inmunotransferencia con HFSC Ror2+/+ y Ror2-/- tratadas con DMSO (vehículo) o CHIR-99021 (GSK3i) durante 24 h. Las barras de escala en c y d representan 15 y 50 μm, respectivamente. Los datos en b–e se reportan como promedio ± sd; n = 3 experimentos independientes; **p < 0,005, ***p < 0,0005 (b), **p = 0,0035 (c), **p = 0,0024 (d), *p = 0,02 (e). Todos los valores de p se calcularon utilizando la prueba t de dos lados no apareados. Todos los resultados de inmunotransferencia son representativos de al menos dos experimentos independientes. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

ATM y ATR son reguladores centrales de DDR, y ATM también funciona como un sensor redox para controlar el nivel de ROS. La deficiencia de ATM aumenta el nivel de ROS y reduce la respuesta antioxidante dependiente de NRF237,42,43. El exceso de producción de ROS y la acumulación de daños en el ADN en las HFSC Ror2-/- nos llevaron a postular que el agotamiento de Ror2 podría afectar la DDR dependiente de ATM y/o ATR. Para probar esta posibilidad, examinamos la actividad de ATM, así como la actividad de ATR, que podría actuar como un regulador complementario para ATM en DDR73. Los análisis de inmunotransferencia mostraron una reducción drástica de la actividad y la expresión total de proteínas de ATM y, en menor medida, de ATR, en Ror2-/- HFSC (Fig. 5f). La actividad ATM/ATR reducida en Ror2-/- HFSC se confirmó aún más por los niveles reducidos en la fosforilación de sustratos ATM/ATR que regulan los puntos de control del ciclo celular y la reparación del ADN73 (Fig. 5g). Más específicamente, CHK2 y CHK1, los objetivos directos aguas abajo de ATM y ATR, respectivamente, se regularon a la baja en Ror2-/- HFSC (Fig. 5b complementaria).

Debido al nivel elevado de ROS, la regulación a la baja de ATM en Ror2-/- HFSC también podría comprometer los efectores descendentes de ATM activados por ROS, AMPK y NRF2. De hecho, la fosforilación de AMPK y NRF2 disminuyó en las HFSC Ror2-/- en comparación con sus células de control (Fig. 5h, i). La regulación a la baja de NRF2 se demostró aún más mediante la notable reducción de NRF2 activado en el núcleo de Ror2-/- HFSC (Fig. 5c complementaria). Curiosamente, se demostró que la inhibición de NRF2 podría conducir a la represión transcripcional de los genes ATM y ATR; por lo tanto, la reducción drástica de la actividad de NRF2 podría explicar por qué los niveles de proteína total de ATM y ATR se vieron comprometidos de manera prominente en las HFSC Ror2-/-.

También se muestra que GSK3β inhibe la actividad de AMPK74 y regula la degradación de NRF275; por lo tanto, la actividad de GSK3β desatada en Ror2-/- HFSC podría ser una de las causas que conducen a su regulación a la baja. De hecho, la inhibición de la actividad de GSK3β mediante el tratamiento del inhibidor de GSK3 podría restaurar el nivel de expresión y la actividad de NRF2 en las HFSC Ror2-/- a niveles comparables con los de las HFSC Ror2+/+, pero no tuvo ningún efecto sobre la actividad de AMPK (Fig. 5j ). Estos datos sugieren que el exceso de actividad de GSK3β como resultado de la pérdida de ROR2 contribuyó en parte a la respuesta oxidativa desequilibrada en Ror2-/- HFSC. En resumen, nuestros resultados revelan un papel previamente no reconocido de ROR2 en la regulación de DDR dependiente de ATM/ATR en HFSC. Sin ROR2, las HFSC no pueden reparar adecuadamente el daño del ADN y equilibrar la producción/eliminación de ROS atribuidas a las deficiencias en la activación de ATM, ATR y su señalización posterior, lo que eventualmente conduce a un crecimiento celular lento, acumulación de daños en el ADN no reparados y la elevación de ROS (Fig. 5d complementaria).

A diferencia de las HFSC Ror2 cKO, las HFSC sin β-catenina se mantienen en su nicho a largo plazo, a pesar de su incapacidad para activarse durante el ciclo de HF63. Sin embargo, el mecanismo que previene el agotamiento de HFSC sin β-catenina del conjunto de células madre sigue sin estar claro. Usando una línea de ratón mutante condicional inducible para β-catenina (K15CrePGR;Ctnnb1fl/fl;ROSA26LSL−YFP), agotamos la β-catenina en HFSC y sus progenies en P18–25, y encontramos que β-catenina cKO (β-cat KO ) Los HF mostraron un retraso en la entrada anágena en el primer ciclo del cabello y luego se mantuvieron en el segundo telógeno durante el resto de la vida, como lo demuestra el retraso y la incapacidad de recuperación del pelo, respectivamente (Fig. 6a). En particular, los HF cKO β-cat detenidos mantuvieron los compartimentos abultados intactos (Fig. 6a, abajo a la derecha), lo que también se encontró en el estudio anterior donde la β-catenina se agotó en HFSC en el segundo telógeno63. Curiosamente, al analizar la expresión de los genes de tallo HFSC en β-cat Ctrl y cKO HFSC en la segunda fase telógena, encontramos una asociación de niveles de expresión más bajos de genes de tallo HFSC con la regulación positiva de la expresión de Ror2. En el telógeno temprano, las HFSC cKO β-cat mostraron niveles similares o ligeramente elevados de genes de tallo HFSC; en estos HFSC, el nivel de expresión del ARNm de Ror2 fue comparable con el de sus HFSC de control (Fig. 6b, arriba). Sin embargo, en los telógenos tardíos β-cat cKO HFSC donde la expresión de los genes de tallo HFSC disminuyó, el nivel de ARNm de Ror2 se elevó (Fig. 6b, centro). La elevación de la expresión de Ror2 se retuvo en las HFSC cKO β-cat de animales viejos (Fig. 6b, abajo). De acuerdo, la expresión elevada de Ror2 en β-cat cKO HFSC en el telógeno tardío y HF envejecido se confirmó mediante inmunotinción de montaje completo, lo que muestra que la expresión de ROR2 fue mayor en la protuberancia de β-cat cKO HF que en Ctrl HF en el segundo telógeno tardío ( Fig. 6a complementaria), así como en animales de edad avanzada (Fig. 6b complementaria).

un β-cat cKO HF permanece en fase telógena de forma permanente sin perder el compartimento HFSC. (Arriba) Diagrama esquemático que ilustra la progresión del ciclo del cabello de ratones β-cat Ctrl y cKO. (Abajo a la izquierda) El ratón β-Cat cKO mostró un retraso en la recuperación del pelaje en el primer anágeno (P31), y luego permaneció en el segundo telógeno de forma permanente sin ingresar al siguiente ciclo de pelo, como lo demuestra la falta de recuperación del pelaje de la piel afeitada de el animal más viejo (P198). (Abajo a la derecha) Tinción Oil Red O de sebocitos en pieles de montaje completo de ratones β-cat Ctrl y cKO. El compartimento protuberante de los HF cKO de β-cat en animales viejos está intacto y se mantienen los HFSC. b Análisis de PCR en tiempo real de HFSC β-cat Ctrl y cKO purificadas con FACS de HF telógeno temprano (P55-60), tardío (P65-90) y envejecido (>P250). Los valores de β-cat cKO HFSC se normalizaron a ARNm de β-cat Ctrl HFSC para cada conjunto. c El agotamiento de Ror2 en β-cat cKO HF da como resultado la pérdida de HFSC y una diferenciación de destino incorrecta. (Arriba) Diagrama esquemático que ilustra la progresión del ciclo del cabello de los ratones Ror2/β-cat Ctrl, Ror2 cKO, β-cat cKO y Ror2/β-cat dKO. (Abajo a la izquierda) Tinción Oil Red O de sebocitos en pieles de montaje completo de ratones Ror2/β-cat Ctrl, Ror2 cKO, β-cat cKO y Ror2/β-cat dKO. (Abajo a la derecha) Se muestra la cuantificación de HF con estructura normal, glándulas sebáceas agrandadas (SG) o acompañadas de protuberancia disminuida. d Imágenes de inmunofluorescencia de pieles de montaje completo de ratones Ror2/β-cat Ctrl y dKO para YFP. Los resultados representan al menos tres experimentos independientes. e Análisis de PCR en tiempo real de Ror2/β-cat Ctrl y dKO HFSC para genes de tallo HFSC. Los valores se normalizaron al ARNm de Ror2/β-cat Ctrl HFSC. Las barras de escala en a, c, d representan 50 μm. Los datos en b y e se reportan como promedio ± sd; n = 4 (para Early Tel), 5 (para Late Tel), o 3 (para Aged Tel) animales biológicamente independientes (b), n = 4 animales biológicamente independientes (e); *p < 0,05, **p < 0,005, ***p < 0,0005. Prueba t de dos lados no apareados. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para investigar si ROR2 regulado al alza en β-cat cKO HFSC desempeña un papel en el mantenimiento de HFSC, generamos una línea de ratón doble mutante condicional inducible para Ror2 y β-catenina (K15CrePGR; Ror2fl/fl; Ctnnb1fl/fl; ROSA26LSL−YFP), referida como Ror2/β-cat dKO. El agotamiento de Ror2 y/o β-catenina se inició mediante la administración de RU486 a ratones en P18-25. De manera similar a los ratones Ror2 cKO y β-cat cKO, los ratones Ror2/β-cat dKO también mostraron un retraso en la entrada de anágena en el primer ciclo capilar (Fig. 6c, arriba). Sin embargo, al inicio del segundo anágeno, mientras que los HF cKO de Ror2 mostraban continuamente el retraso de la entrada de anágeno (Fig. 1e) y los HF cKO de β-cat se detenían en telógeno (Fig. 6a y Fig. 7a complementaria), Ror2 / β- cat dKO HF no pudo iniciar el ciclo del cabello y mostró signos de diferenciación masiva de sebocitos (Fig. 6c y Fig. 7b complementaria). El análisis cuantitativo de HF de ratones Ctrl, Ror2 cKO, β-cat cKO y Ror2/β-cat dKO demostró que el fenotipo que muestra glándulas sebáceas agrandadas (SG) solo se observó en Ror2/β-cat dKO HF y que más de un la mitad de los HF Ror2 / β-cat dKO mostraron SG agrandados acompañados de una estructura HF aberrante o compartimentos abultados disminuidos (Fig. 6c, parte inferior). La inmunotinción de HF de montaje completo reveló la pérdida gradual de CD34 + Ror2 / β-cat dKO HFSC junto con la ampliación de SG (Fig. 7c complementaria). El rastreo de linaje con YFP confirmó que estos sebocitos diferenciados que residen en SG agrandados se generaron a partir de YFP + Ror2 / β-cat dKO HFSC activados con Cre (Fig. 6d). El agotamiento de Ror2 y β-catenina se confirmó en YFP + Ror2 / β-cat dKO HFSC purificados por FACS que mostraron una regulación negativa prominente de los genes de tallo HFSC (Fig. 6e); esta regulación a la baja fue incluso más significativa que la de Ror2 cKO (Fig. 2e, f) o en los últimos telógenos β-cat cKO HFSC (Fig. 6b). En resumen, nuestros resultados revelan un papel previamente no reconocido de ROR2 en el mantenimiento a largo plazo de las HFSC, que es especialmente importante para aquellas HFSC que sufrirían una diferenciación de destino incorrecta tras la activación.

Hemos demostrado que se requiere ROR2 para la activación de JNK y PKC inducida por Wnt (Fig. 4a). Sin estimulación Wnt adicional, las actividades generales de JNK y PKC ya eran más bajas en las HFSC Ror2-/- que mostraron una reducción significativa en p-GSK3βS9 en el medio de cultivo regular (Fig. 8a complementaria). Además de las HFSC cultivadas, también encontramos que tanto las formas totales como las activadas de las proteínas JNK y PKC se redujeron significativamente en las HFSC Ror2 cKO activadas por depilación (Fig. 7a). La inmunotinción de la piel Ror2 Ctrl y cKO de montaje completo al inicio de la anágena confirmó la reducción de la expresión de las proteínas JNK y PKC y sus actividades en las HFSC Ror2 cKO activadas por depilación (Fig. 8b complementaria). En particular, la reducción de la expresión de PKC en Ror2 cKO HFSC que mostró una expresión disminuida de ROR2 persistió en la fase telógena (Fig. 7b). Para abordar si los efectos del agotamiento de Ror2 en la proliferación y el mantenimiento de HFSC fueron causados ​​por la regulación negativa de JNK y/o PKC en Ror2-/- HFSC, utilizamos inhibidores de molécula pequeña, SP600125 (inhibidor de JNK; JNKi) y GF109203X (inhibidor selectivo de PKC). a isoformas de PKC clásicas y novedosas; PKCi), para suprimir las actividades de JNK y PKC de HFSC cultivadas, respectivamente, y luego examinó sus efectos en la proliferación de HFSC mediante la realización de experimentos de etiquetado EdU. Como se muestra, la inhibición de PKC, pero no de JNK, borró las diferencias en la proliferación celular entre Ror2+/+ y Ror2-/- HFSC (Fig. 8c complementaria), lo que sugiere que ROR2 regula la proliferación de HFSC, al menos en parte, a través de la señalización dependiente de PKC .

a Análisis de inmunotransferencia de HFSC purificados con FACS de 3dpd Ror2 Ctrl y cKO HF. b Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de telógeno tardío Ror2 Ctrl y cKO HF para ROR2 (rojo) y PKCα (verde). A la derecha se muestran los análisis de cuantificación de la intensidad de fluorescencia para la tinción de ROR2 y PKCα. Los datos se informan como la mediana (la línea dentro del cuadro), los percentiles 25 a 75 (líneas inferior y superior del cuadro) y los percentiles 10 a 90 (bigotes inferior y superior); n = 18 (Ctrl) o 20 (cKO) regiones sobre 7 (Ctrl) u 8 (cKO) HF independientes; *** p < 0,0001. Prueba t de dos lados no apareados. c Análisis de inmunotransferencia para las proteínas indicadas con HFSC Ror2+/+ y Ror2-/- que se trataron con DMSO (vehículo) o GF109203X (PKCi) durante 24 h. d La inhibición de PKC en HF cKO β-cat conduce a la pérdida de HFSC y a una diferenciación de destino incorrecta. (Arriba) Diagrama esquemático que ilustra la progresión del ciclo del cabello de Ror2/β-cat Ctrl, ratones dKO y ratones β-cat cKO tratados con inhibidor de PKC en la segunda fase telógena. (Abajo) Se muestran la tinción Oil Red O de sebocitos en pieles de montaje completo 1 semana después del tratamiento (izquierda) y la cuantificación de HF (derecha). e Análisis de PCR en tiempo real de HFSC purificados con FACS de ratones β-cat Ctrl o cKO tratados con acetona (vehículo) o GF109203X (PKCi) durante 24 h. Los valores de β-cat Ctrl y cKO HFSC tratados con GF109203X se normalizaron al ARNm de β-cat Ctrl y cKO HFSC tratados con vehículo, respectivamente. Los datos se reportan como promedio ± sd; n = 3 animales biológicamente independientes; *p < 0,05, **p < 0,005. Prueba t de dos lados no apareados. f Un modelo ilustrativo que resume nuestros resultados en este estudio. En HFSC, ROR2 no solo transduce la señalización Wnt no canónica inducida por Wnt5a a través de la activación de PKC, JNK y pequeñas GTPasas, sino que también modula la señalización Wnt canónica inducida por Wnt3a al controlar la estabilidad de GSK3β. Paralelamente, ROR2 también juega un papel en la regulación de DDR dependiente de ATM/ATR. Estas regulaciones dependientes de ROR2 modulan la proliferación celular, la motilidad y la reparación del ADN, que son esenciales para el mantenimiento a largo plazo de las HFSC. Todos los resultados de inmunotransferencia son representativos de al menos dos experimentos independientes. Las barras de escala en b, d representan 50 μm. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se muestra que PKC fosforila e inactiva GSK3β76,77, nos preguntamos si la inhibición de PKC podría recapitular en parte la pérdida de Ror2 al aliviar la inactivación de GSK3β. Como se muestra, la inhibición de PKC, validada por la reducción de la actividad de PKC y el nivel de proteína total tras el tratamiento con PKCi, comprometió la inactivación de GSK3β en las HFSC Ror2+/+ a un nivel similarmente bajo al de las HFSC Ror2-/- (Fig. 7c), lo que sugiere que la reducción de La actividad de PKC tras el agotamiento de Ror2 podría ser una de las causas que conducen a una actividad elevada de GSK3β. Curiosamente, mientras aumentaba la estabilidad de GSK3β, la inhibición de PKC solo tuvo efectos menores sobre la estabilidad de β-catenina y la actividad transcripcional dependiente de β-catenina juzgada respectivamente por los niveles de fosforilación/expresión de β-catenina y la expresión del gen diana canónico Wnt (Fig. 7c y Complementario). Figura 9a). Estos datos implican que la PKC modula principalmente el grupo citoplásmico de GSK3β en las HFSC. Además, de acuerdo con el hecho de que GSK3β modula negativamente la actividad de NRF2 en HFSC (Fig. 5j), la inhibición de PKC, que estabilizó GSK3β, resultó en una disminución en la actividad de NRF2 sin mostrar efectos significativos en la activación de AMPK (Suplementario Fig. 9b). En conjunto, nuestros resultados implican que, además de comprometer la activación de la señalización dependiente de Wnt, la pérdida de ROR2 también resultó en la regulación negativa de PKC, lo que podría contribuir a la estabilización de GSK3β y la inactivación de NRF2, lo que conduce a una respuesta oxidativa desequilibrada.

Hemos demostrado que la expresión de ROR2 estaba elevada en HFSC cKO β-cat en HF telógeno tardío y HF envejecido (Fig. 6 complementaria); Curiosamente, también detectamos una mayor expresión de PKC en estos HFSC cKO β-cat de HF telógeno tardío (Fig. 10a complementaria), así como en animales envejecidos (Fig. 10b complementaria). Para determinar si la PKC desempeña un papel aguas abajo de ROR2 en las HFSC β-cat cKO, inhibimos la actividad de PKC aplicando PKCi a la piel de la espalda de los ratones β-cat Ctrl y cKO durante el segundo telógeno (Fig. 7d, arriba). En particular, 1 semana después de la aplicación de PKCi, las HFSC cKO β-cat ya habían experimentado la diferenciación de sebocitos, y 3 semanas después del tratamiento, el 77% de las HF cKO β-cat perdieron sus compartimentos protuberantes acompañados de SG agrandados (Fig. 7d y Fig. Suplementaria). 10c). El fenotipo de HF cKO β-cat de la inhibición de PKC recapituló el efecto del agotamiento de Ror2 en HFSC cKO β-cat, lo que sugiere que PKC actúa en el mismo eje que ROR2 en la regulación del mantenimiento de HFSC. Además, encontramos que el efecto de la inhibición de PKC en la regulación a la baja de los genes de tallo HFSC fue mayor en los HFSC cKO β-cat que en los HFSC Ctrl β-cat (Fig. 7e), lo que sugiere que PKC en HFSC cKO β-cat juega un papel aguas abajo de ROR2 en el mantenimiento de HFSC. Juntos, nuestros hallazgos colectivos brindan evidencia convincente de que la regulación dependiente de ROR2 es vital para la proliferación y el mantenimiento de los HFSC, especialmente cuando los HFSC no pueden diferenciarse adecuadamente.

Una extensa investigación sobre cómo la señalización de Wnt modula el comportamiento de las células madre se ha centrado en la vía Wnt canónica dependiente de β-catenina, pero se puede encontrar información muy limitada sobre la señalización independiente de β-catenina en el nicho de células madre. Esta brecha conceptual nos ha llevado a investigar la importancia funcional de un receptor Wnt ROR2 en la regulación de células madre utilizando el HF como sistema modelo. Usando un modelo de ratón genético, demostramos que ROR2 es indispensable para la autorrenovación y el mantenimiento a largo plazo de HFSC. Análisis adicionales con cultivos de HFSC demostraron que ROR2 no solo transduce la señalización y migración Wnt no canónica activada por Wnt5a a través de la activación de PKC, JNK y pequeñas GTPasas, sino que también es necesario para la expresión inducida por Wnt3a de genes diana de Wnt canónicos en HFSC a través de la regulación de GSK3β estabilidad. Sorprendentemente, al buscar la regulación dependiente de ROR2 responsable del mantenimiento de HFSC, descubrimos una función previamente no reconocida de ROR2 en la regulación de DDR dependiente de ATM/ATR, que es importante para el mantenimiento de la integridad genómica de HFSC. Por último, nuestros análisis con HFSC sin β-catenina revelaron aún más un papel compensatorio de la señalización de ROR2-PKC en la protección de las HFSC, especialmente para aquellos que no pueden diferenciarse adecuadamente, de la pérdida incontrolable. En conjunto, nuestros resultados brindan una idea de una red de señalización regulada de forma cruzada por un receptor Wnt en el contexto de las células madre (Fig. 7f).

Varios estudios han respaldado la idea de que ROR2 media el antagonismo dependiente de Wnt5a de la señalización de Wnt/β-catenina22,30,31,32,33. Sin embargo, nuestros datos indican que ROR2 no solo es responsable de la activación de la señalización dependiente de Wnt5a, sino que también es esencial para la regulación transcripcional canónica activada por Wnt en HFSC. Demostramos que los genes diana canónicos de Wnt estaban regulados a la baja en HFSC con Ror2 empobrecido tras la activación de HFSC inducida por depilación y al inicio de la anágena, estos procesos se rigen predominantemente por la señalización de Wnt/β-catenina para promover la entrada en el ciclo del cabello61,63. También encontramos que el agotamiento de Ror2 disminuyó la activación transcripcional inducida por Wnt3a en HFSC cultivadas debido a la actividad GSK3β desatada. Los análisis tanto in vivo como in vitro indican que ROR2 favorece la activación en lugar de la antagonización de la señalización de Wnt/β-catenina en HFSC mediante la regulación de la estabilidad de GSK3β. Nuestros hallazgos están de acuerdo con los estudios que muestran que ROR2 sobreexpresado puede potenciar la actividad de señalización de β-catenina inducida por Wnt3a medida por el reportero de señalización de Wnt/β-catenina31,35,36. Sin embargo, nuestro modelo de investigación ofrece un contexto fisiológico que nos permite determinar la acción del ROR2 endógeno en la regulación de la señalización de Wnt/β-catenina.

Se ha demostrado que las HFSC residen en el nicho rico en ligandos Wnt no canónicos, por ejemplo, Wnt4 y Wnt11, a lo largo del ciclo del cabello56,66,78, lo que implica la posibilidad de que la señalización de Wnt no canónica se active en las HFSC para el mantenimiento. En nuestro estudio, demostramos que ROR2 es esencial para activar la señalización inducida por Wnt no canónica en HFSC, y que una población de HFSC no podría mantenerse sin ROR2. Además, en los HFSC cKO β-cat donde se suprime la señalización canónica de Wnt, ROR2 se regula al alza para proteger a los HFSC nulos de β-catenina de la pérdida. Todos estos hallazgos respaldan un modelo en el que la regulación dependiente de ROR2, al menos parcialmente activada por Wnt no canónicos, desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de los HFSC en estado inactivo y/o activado. Al examinar las HFSC empobrecidas en Ror2 en cultivo, identificamos la regulación dependiente de ROR2 en DDR mediada por ATM/ATR, que es crucial para el mantenimiento a largo plazo de las HFSC. Sin embargo, no está claro si los HFSC que residen en su nicho utilizan este mecanismo y si la regulación de DDR por ROR2 depende de Wnt. Por lo tanto, la investigación futura debe centrarse en analizar la dependencia de Wnt en la regulación mediada por ROR2 y descifrar el mecanismo de ROR2 que subyace a la regulación mencionada anteriormente, por ejemplo, mediante la identificación de proteínas que interactúan con ROR2.

Nuestros análisis con el modelo de ratón in vivo muestran que aunque una población de HFSC con Ror2 empobrecido se perdió después de la primera ronda de regeneración de HF, las HFSC de Ror2 cKO recuperadas después del proceso pudieron mantener y reponer el linaje de HF en la siguiente regeneración. Sin embargo, las HFSC Ror2 cKO purificadas con FACS no se pudieron mantener en cultivo a largo plazo en el medio que promueve la proliferación. Esta discrepancia en la supervivencia de HFSC in vivo y en cultivo probablemente se deba a las diferencias en la frecuencia de proliferación de HFSC. Las HFSC que residen en su nicho nativo se mantienen en estado de reposo hasta el inicio del ciclo capilar. Incluso al inicio de la fase anágena, solo un subconjunto de HFSC experimenta proliferación para la autorrenovación y regeneración. Por el contrario, las HFSC en cultivo están en constante proliferación, lo que hace que las HFSC sean vulnerables al daño del ADN. Dada la deficiencia de HFSC empobrecidos en Ror2 en DDR dependiente de ATM/ATR, la alta frecuencia de replicación del ADN podría conducir a una rápida acumulación de daño en el ADN, lo que posteriormente provoca la detención o muerte del ciclo celular. Esto explica por qué las HFSC Ror2 cKO en cultivo mostraron fenotipos más fuertes que los que residen en su nicho.

Nuestra identificación de los roles duales de ROR2 involucrados en la señalización de Wnt canónica y no canónica cristalizó la idea de que las células explotan diferentes componentes de señalización de Wnt para construir una red de señalización de Wnt para mantener la estabilidad del estado celular. La capacidad de ROR2 para transducir señales específicas de la condición probablemente implica la disponibilidad de correceptores, proteínas que interactúan o efectores aguas abajo. Por lo tanto, la señalización dependiente de ROR2 puede desencadenar efectos específicos del tipo de célula y conducir a un resultado funcional dependiente de la situación. Esta última conjetura puede proporcionar la flexibilidad requerida al sistema para realizar múltiples funciones. Los estudios futuros deberían profundizar en las interacciones entre la señalización Wnt canónica y no canónica dependiente de ROR2 que contribuye a la autorrenovación y el mantenimiento de las HFSC.

Los ratones se alojaron y trataron de acuerdo con las directrices del Comité de Ética Animal de la Universidad, Université Catholique de Louvain. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de conformidad con las normas de bienestar animal de Bélgica. Todos los ratones de laboratorio se alojan en ciclos de luz de 12:12 luz:oscuridad a temperatura ambiente de 20 a 24 °C y rangos de humedad de 45 a 65 %. Se obtuvieron ratones K15CrePGR y Ror2fl/fl en un fondo C57BL/6J del laboratorio de Jackson. Se generaron líneas de ratones knockout inducibles cruzando K15CrePGR79, Ror2fl/fl y/o Ctnnb1fl/fl,80, ROSA26LSL-YFP,81. La estrategia para generar Ror2 cKO y sus compañeros de camada de control fue cruzando machos K15CrePGR+;Ror2+/fl;Rosa26LSL-YFP con Ror2fl/fl; Rosa26LSL-YFP hembras. Los animales de control para ratones Ror2 cKO eran compañeros de camada heterocigotos (Cre+) Ror2 emparejados por sexo, o compañeros de camada de tipo salvaje (Cre-) solo cuando los compañeros de camada de ratones Ror2 cKO no contenían ningún ratón heterocigoto Ror2. La actividad cre-recombinasa se indujo mediante inyección intraperitoneal de RU486 (1 mg/ratón; TCI Europe NV) en P18, P21 y P24, y la administración tópica diaria de RU486 al 4 % en etanol de P21 a P25. Para inducir la activación sincronizada de HFSC, se realizó una depilación con HF en ratones anestesiados en P55. Para el tratamiento con inhibidores de PKC, se aplicaron 100 μg de GF109203X (R&D Systems) en acetona (1 μg/μl) o acetona sola a la piel del dorso del ratón P55 en días alternos durante 3 días. Los experimentos se diseñaron en base a pares de sexo, edad y cepa, principalmente compañeros de camada, y se repitieron en ≥3 pares de conjuntos de muestras. El fenotipo y los resultados obtenidos fueron reproducibles tanto en parejas masculinas como femeninas.

Los procedimientos de purificación de FACS fueron los descritos anteriormente63,78. Brevemente, se cosechó la piel dorsal, se desechó para eliminar la grasa y se incubó en tripsina al 0,25 % durante 30 min (hembras) o 40 min (machos) a 37 °C. Las células epidérmicas y HF se rasparon y la suspensión celular se filtró a través de filtros celulares de 70 y 40 µm (Fischer Scientific). Las células recolectadas se suspendieron en PBS que contenía FBS al 4 % y se incubaron con anticuerpos antes de la FACS. A continuación, las células teñidas se clasificaron utilizando un FACS Aria III (BD Biosciences) con el software FACS Diva v8.0.1. Se usó Fixable Viability Dye eFluor 780 para excluir las células muertas. Luego, las HFSC vivas se clasificaron en función de la expresión superficial de integrina α6, CD34 y YFP citosólica. El esquema de activación de FACS se proporciona en la Fig. 11 complementaria. Las células se recolectaron en reactivo TRI (Sigma-Aldrich) para la purificación de ARN, tubos Flacon de 15 ml prerrecubiertos para la purificación de proteínas o medio de cultivo con células alimentadoras para formación de colonias.

Las biopsias de piel se recolectaron y fijaron en paraformaldehído al 4 % a 4 °C durante 4 h, y luego se sumergieron en sacarosa al 30 % a 4 °C durante la noche antes de incluirlas en el compuesto OCT. Para montajes completos de piel, se eliminó la grasa de la piel de la espalda y luego se incubó en 2 mg/ml de dispasa (Thermo Fisher Scientific) complementada con EDTA 20 mM a 4 °C durante la noche. La epidermis de la piel con los folículos pilosos adjuntos se despegó de la dermis y se fijó en PFA al 4 % durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT). Las pieles lavadas de montaje completo se almacenaron en PBS a 4 ° C para su uso posterior.

Para la inmunofluorescencia, se fijaron, lavaron y permeabilizaron secciones de tejido de 7 µm en Triton-X100 al 0,5 % durante 20 min. A continuación, las secciones se incubaron en tampón de bloqueo de inmunofluorescencia (0,3 % Triton X-100, 1 % de albúmina de suero bovino, 1 % de gelatina, 5 % de suero normal de cabra, 5 % de suero normal de burro en PBS) a temperatura ambiente durante 1 h y luego con anticuerpos a 4 ° C durante la noche. Cuando correspondía, se utilizó el kit de fluoresceína MOM (Vector Laboratories) para evitar la unión no específica de anticuerpos monoclonales de ratón primarios. Las secciones de tejido se lavaron y se incubaron con anticuerpo secundario conjugado con Alexa Fluor (Jackson ImmunoResearch) a temperatura ambiente durante 1 hora antes de montarlas con medio de montaje que contenía DAPI (Roth). Para los tejidos de montaje completo, la inmunotinción se realizó como se describió anteriormente con la incubación durante la noche de los anticuerpos primarios a 4 °C63. Las imágenes de la tinción de inmunofluorescencia se adquirieron utilizando el software Zen v3.0 (Zeiss) en un microscopio de fluorescencia Axio Vert.A1 (Zeiss) o el software Zen v2.6 (Zeiss) en un microscopio confocal Axio Observer Z1 (Zeiss). La intensidad de la fluorescencia se midió usando ImageJ.

Para detectar la proliferación de HFSC in vivo, se inyectó intraperitonealmente 1 mg de EdU (5-etinil-2′-desoxiuridina; TCI Europe) por ratón dos veces a intervalos de 12 h durante 24 h antes de recolectar muestras de piel. Para el ensayo de marcado de EdU in vitro, se cultivaron HFSC en portaobjetos de cámara Nunc Lab-Tek II (Thermo Fisher Scientific) recubiertos con 10 μg/ml de fibronectina (Merck Millipore). Las células se incubaron con DMSO (vehículo), 2 μM de SP600125 (JNKi) o 0,5 μM de GF109203X (PKCi) durante 24 h y luego se marcaron con 10 μM EdU durante 4 h antes de la detección. La EdU incorporada se detectó mediante un kit de imágenes Click-iT EdU Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific) según las instrucciones del fabricante.

Para los ensayos de formación de colonias, se sembraron HFSC purificadas con FACS a 20 000 células/pocillo (para HF de inicio anágeno) o 33 000 células/pocillo (para HF de fase telógena) de placas de seis pocillos que contenían alimentadores de fibroblastos de ratón J2 3T3 tratados con mitomicina C ( amable obsequio de E. Fuchs lab por acuerdo con H. Green lab). Después de dos semanas de cultivo conjunto, las colonias se fijaron con paraformaldehído al 4 % y se tiñeron con rodamina B al 1 %. Se contaron las colonias con tamaños ≥ 3 mm2 para el análisis. Para los experimentos de pases a largo plazo, se seleccionaron tres grupos independientes de 6 colonias por grupo con cilindros de clonación (Bel-Art) y se pasaron a alimentadores de fibroblastos tratados con mitomicina C en una placa de 24 pocillos. Las HFSC se tripsinizaron y se pasaron a una dilución 1:10 en alimentadores cada 10 días durante 10 pases. La expresión de Ror2 de cada colonia individual fue validada por RT-qPCR.

Las HFSC purificadas con FACS de la piel de la espalda de ratones Ror2fl/fl/ROSA26LSL-YFP se cultivaron y expandieron en alimentadores de fibroblastos tratados con mitomicina C en un medio que contenía calcio 0,3 mM como se describe82. Después de 10 pases, las HFSC se retiraron de los comederos y se prepararon para la infección lentiviral. Para el tratamiento de Wnt, las HFSC se privaron de medio que contenía 0,5 % de FBS durante 16 h y luego se trataron con vehículo (PBS), 100 ng/ml de Wnt3a sin portador (R&D Systems) o 300 ng/ml de Wnt5a (R&D Systems) durante 30 o 60 min antes de la recolección para la purificación de proteínas, o durante 6 h para la purificación de ARNm. Para el tratamiento del inhibidor de GSK3 o PKC, las HFSC se trataron con vehículo (DMSO) o 1 µM de CHIR99021 (R&D Systems) o 1 µM de GF109203X (R&D Systems) durante 24 h antes de la recolección para la extracción de proteínas.

Para el ensayo de migración celular direccional, se realizó un ensayo colorimétrico de migración celular QCM de 24 pocillos (Merck) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para analizar la capacidad de migración celular colectiva, se realizó un ensayo de migración de heridas por rascado. Brevemente, se cultivaron HFSC sin alimentador para crecer en una monocapa confluente, y luego se raspó en línea recta la monocapa de HFSC en el medio que contenía 1% de FBS con o sin 8 µg/ml de mitomicina C (Merck) usando una punta de pipeta. para crear una brecha. Las imágenes del cierre de la brecha se adquirieron usando un microscopio de contraste de fase a las 0, 8 y 24 h después del raspado, y las brechas en cada punto de tiempo se midieron usando ImageJ. Los datos presentados son los promedios de tres experimentos independientes.

Para el análisis del ciclo celular, el ADN de las HFSC se tiñó con 10 µg/ml de DAPI a 37 °C durante 1 h, y el contenido de ADN se midió con un citómetro de flujo LSR Fortessa con el software FACS Diva v8.0.1 (BD Biosciences) y se analizó con FlowJo. software v10.7.2. Para medir el nivel de ROS intracelular, las HFSC se tiñeron con el reactivo CellROX Deep Red (Thermo Fisher Scientific) y se analizaron con un citómetro de flujo LSR Fortessa de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las células HEK293FT (Thermo Fisher Scientific) se transfectaron con CaCl2 con una mezcla de plásmidos que contenía plásmido de expresión lentiviral pLKO.1, plásmidos de empaquetamiento viral PAX2 y MD2. 48 h después de la transfección, el sobrenadante que contenía virus de las células HEK293FT transfectadas se recogió, filtró y mezcló con polibreno (Sigma-Aldrich) y un 10 % adicional de FBS antes de aplicarlo a Ror2fl/fl/ROSA26LSL-YFP HFSC. La infección viral se realizó mediante centrifugación de HFSC con una mezcla que contenía virus a 1100 × g a 35 ° C durante 1 h. 5 días después de la infección, las HFSC se purificaron mediante FACS en función de la expresión de RFP y/o YFP. Se utilizaron los siguientes plásmidos de expresión lentiviral: pLKO.1-NLS-iCre-mRFP (obsequio de S. Beronja)83, pLKO.1-MCS-mRFP (derivado de pLKO.1-NLS-iCre-mRFP donde NLS-iCre fue reemplazado por múltiples sitios de clonación).

Los ARN totales de células clasificadas por FACS o células cultivadas se purificaron con el kit Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research) y se transcribieron inversamente con el kit de síntesis de ADNc ProtoScript(r) II First Strand (New England Biolabs). Los ADNc se amplificaron con los cebadores indicados en el ensayo PCR cuantitativo SYBR Green (Bio-Rad) en el sistema de PCR en tiempo real Thermoblock 96 Silver Block (Bio-Rad) y los números de ciclo se registraron con el software CFX Manager v3.1. Los niveles de expresión relativos se normalizaron con respecto a la amplificación por PCR del gen doméstico Ppib2 o Rps16. Los cebadores utilizados para la expresión de ARNm se enumeran en la Tabla complementaria 1. Las barras de error para los análisis de qPCR se calcularon a partir de las réplicas biológicas independientes (n ≥ 3) indicadas en cada conjunto de datos.

Las HFSC se privaron de alimento y luego se trataron con 300 ng/ml de Wnt5a durante 2 h antes de la recolección para el ensayo de activación de GTPasa pequeña. Para el ensayo de activación de GTPasa pequeño, se realizó el kit combinado de ensayo de activación Rac1/Cdc42 (Cell Biolabs) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para el análisis de inmunotransferencia, las proteínas se extrajeron de las células con tampón RIPA (Tris-HCl 50 mM, NaCl 100 mM, NP-40 al 1 %, desoxicolato de Na al 0,5 %, SDS al 0,1 %, EDTA 1 mM, inhibidor de proteasa, inhibidores de fosfatasa) . Luego, los lisados ​​​​de proteínas se cargaron en un gel Bis-Tris al 4-12% (Thermo Fisher Scientific) y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Thermo Fisher Scientific). Las membranas transferidas se bloquearon con BSA al 5 % en tampón TBST a temperatura ambiente durante 1 h y luego se incubaron con anticuerpos primarios a 4 °C durante la noche. Después de la incubación, las transferencias se lavaron y luego se incubaron con los anticuerpos secundarios conjugados con HRP (Jackson ImmunoResearch) durante 1 h. Las transferencias se desarrollaron con el reactivo de detección de quimioluminiscencia (sustratos SuperSignal West, Thermo Fisher Scientific), y luego se detectaron las señales con el sistema de imágenes Fusion SL (Vilber) con el software Fusion-Capt Advance Solo 4S v16.16b.

Se usaron los siguientes anticuerpos (Abs) para FACS: colorante de viabilidad F780 (1:200, 65-0865), integrina α6 (1:500, conjugado con PE, clon GoH3, 12-0495) y CD34 (1:100, Conjugado con Alexa Fluor 660, clon RAM34, 50-0341) de eBiosciences. Se usaron los siguientes Abs para la inmunotransferencia: ROR2 (Ror2) del banco de hibridomas de estudios de desarrollo; ROR1 (clon D6T8C, 16540), p-JNKT183/Y185 (clon 81E11, 4668), JNK (clon 56G8, 9258), p-PKCS660 (9371), PKCα (2056), Dvl2 (clon 30D2, 3224), p- LRP6S1490 (2568), LRP6 (clon C5C7, 2560), p-GSK3βS9 (9336), GSK3β (clon 27C10, 9315), p-β-catenina S33/37/T41 (9561), Axin1 (clon C76H11, 2087), CK1 (2655), p-ATMS1981 (clon D6H9, 5883), ATM (clon D2E2, 2873), p-ATRS428 (2853), ATR (2790), p-CHK2T68 (2661), CHK2 (2662), p-CHK1S345 ( clon 133D3, 2348), CHK1 (clon 2G1D5, 2360), p-AMPKT172 (clon 40H9, 2535), AMPKα (2532), α-tubulina (2144), Lamin B1 (clon D9V6H, 13435), Vinculin (clon E1E9V, 13901) y sustratos p-ATM/ATR (2851) de Cell Signaling Technology; p-NRF2S40 (clon EP1809Y, ab76026) y NRF2 (ab137550) de Abcam; β-catenina (clon 15B8, C7207) y β-actina (clon AC-74, A2228) de Sigma-Aldrich; CD34 (Clon RAM34, 13-0341) de eBiosciences; Rac1 (clon 23A8, 05-389), Cdc42 (07-1466) y GAPDH (clon 6C5, MAB374) de Merck-Millipore; Krt5 (905901) y Krt15 (833901) de Biolegend; p-GSK3βY216 (clon 13A, 612313) de BD Biosciences; Anticuerpos secundarios conjugados con HRP (715-035-150, 711-035-152, 712-035-150) de Jackson ImmunoResearch. Todos los anticuerpos primarios utilizados para la inmunotransferencia estaban a una dilución de 1:1000 y los anticuerpos secundarios a una dilución de 1:4000. Se usaron los siguientes Abs para la inmunotinción: ROR2 (1:100, Ror2) del banco de hibridomas de estudios de desarrollo; ROR1 (1:100, 16540), p-JNKT183/Y185 (1:100, 4668), JNK (1:100, 9258), p-PKCS660 (1:100, 9371), PKCα (1:100, 2056) , γH2AX (1:200, BET A300-081A-M) de Cell Signaling Technology; GFP (1:1000, ab13970) de Abcam; β-catenina (1:100, C7207) de Sigma-Aldrich; CD34 (1:100, 13-0341) de eBiosciences; 8-oxoG (1:100, clon 483.15, MAB3560) de Merck-Millipore. Anticuerpos secundarios conjugados con tinte fluorescente (703-545-155, 715-545-150, 715-585-150, 711-545-152, 711-585-152, 712-545-150, 712-585-150) de Jackson ImmunoResearch.

Los experimentos con animales se realizaron en igual número de ratones machos y hembras. Los fenotipos son representativos de un mínimo de tres compañeros de camada emparejados por sexo (n ≥ 3). Los experimentos no fueron aleatorios y los investigadores no fueron cegados durante la recopilación de datos. Todos los resultados de RT-qPCR se generan a partir de al menos tres animales biológicos independientes o experimentos independientes. Todos los resultados del análisis histológico, inmunotransferencia y tinción de inmunofluorescencia son representativos de al menos dos experimentos independientes. Los gráficos se presentaron con GraphPad Prism 8. Los diagramas de caja-bigotes se presentan como la mediana (la línea dentro de la caja), los percentiles 25 a 75 (líneas inferior y superior de la caja) y los percentiles 10 a 90 (las líneas inferior y superior de la caja). ). Los gráficos de puntos se presentaron como la media ± SEM. Otros datos se informaron como promedio ± sd; * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005 o valores de p especificados en las leyendas de las figuras. Los análisis estadísticos se determinaron mediante la prueba t de Student de dos colas para datos no apareados para todos los experimentos.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todos los datos que respaldan este estudio se incluyen en el archivo de datos de origen que se proporciona con este documento. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Agradecemos a Nicolas Dauguet por la clasificación de FACS (instalación de FACS en el Instituto de Duve); Slobodan Beronja, Valeri Vasioukhin, Frederic Lemaigre y Christophe Pierreux por sus discusiones y comentarios. AV y CMRL cuentan con el apoyo de becas FRIA (1.E136.15 para AV y 1.E041.16 para CMRL) del Fonds de la Recherche Scientifique (FNRS) y becas Patrimoine de la Université catholique de Louvain (UCLouvain). GC es becario FSR de UCLouvain y becario aspirante (1.A551.19) de FNRS. CKC cuenta con el apoyo de la beca postdoctoral Fondation Contre le Cancer y FSR de UCLouvain. W.-HL es un investigador independiente de FNRS. Este trabajo fue apoyado por subvenciones (a W.-HL) de FNRS (Ulysse-F.6002.14 y PDR-T.0078.16), Fonds Joseph Maisin (2016-2018) y Fondation Contre le Cancer (FAF-F/2016/ 792).

Estos autores contribuyeron igualmente: Anthony Veltri, Christopher MR Lang.

Instituto de Duve, Universidad Católica de Lovaina, 1200, Bruselas, Bélgica

Anthony Veltri, Christopher MR Lang, Gaia Cangiotti, Chim Kei Chan y Wen-Hui Lien

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AV y W.-HL concibieron los experimentos de estudio y diseño. AV realizó la mayoría de los experimentos, analizó datos y preparó figuras. CL desarrolló ensayos de infección lentiviral y realizó experimentos críticos durante la revisión; GC realizó una parte de los análisis de histología, el cultivo celular y los experimentos de RT-qPCR; CKC realizó una parte de los experimentos FACS, inmunotransferencia, análisis del ciclo celular y medición de ROS; W.-HL supervisó el estudio, realizó algunos experimentos de cultivo celular, analizó datos, preparó figuras y escribió el artículo. Todos los autores proporcionaron aportes intelectuales y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Wen-Hui Lien.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Mingxing Lei, Daniela Ungureanu y los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Veltri, A., Lang, CMR, Cangiotti, G. et al. ROR2 regula la autorrenovación y el mantenimiento de las células madre del folículo piloso. Nat Comun 13, 4449 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32239-7

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Recibido: 26 junio 2019

Aceptado: 21 de julio de 2022

Publicado: 01 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32239-7

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